檢驗檢測

分散液液微萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定茶飲料中黃曲黴毒

2021-08-04 15:42:51 來源: 世界杯賽程預測 導刊

分散液液微萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定茶飲料中黃曲黴毒素B1和B2

陳佩佩1,2,陳琳珊1,2,陳 茹1,3

(1.廣東省食品工業公共實驗室,廣東廣州 511442;2.廣東省食品工業研究所有限公司,廣東廣州 511442;

3.廣東省質量監督食品檢驗站,廣東廣州 511442)

摘 要:建立了分散液液微萃取(DLLME)-超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)對茶飲料中的黃曲黴毒素B1和黃曲黴毒素B2進行同時測定的方法。樣品以鹽酸為分散劑,3-氯苯胺為萃取劑進行萃取,調節pH至6後,離心分層,棄去上層水相,下層乙腈定容,使用電噴霧電離源正離子模式進行測定。結果表明,兩種黃曲黴毒素在1.0~100 μg/L範圍內呈良好線性關係,相關係數大於0.999 3,平均回收率為71.2%~91.0%,檢出限均為20.0 ng/kg,定量限均為50.0 ng/kg,相對標準偏差為2.23%~6.43%。該方法操作快速簡便、回收率好、靈敏度高、重現性好,適用於日常測定茶飲料中的黃曲黴毒素。

關鍵詞:分散液液微萃取;超高效液相色譜-串聯質譜;茶飲料;黃曲黴毒素

黃曲黴毒素(Aflatoxin,AFT)是由黃曲黴和寄生曲黴等某些菌株產生的一類次生代謝物[1],從化學結構上,均屬於雙呋喃香豆素衍生物,是一類毒性極強的雙呋喃環類毒素。由於AFT產生菌在自然界中廣泛存在,很多的動植物源性食品都有可能存在汙染[2],尤其在植物的種植、加工、運輸、儲存等過程都有可能被產生菌汙染,從而產生毒素[3]。同時,黃曲黴毒素在自然條件下穩定性較強,極性較低,難以用水或紫外線完全除去,隻有在強堿性條件下容易分解[4],過多的攝入引起致癌、致畸和致突變等毒性效應[5],其中以黃曲黴毒素B1的毒性致癌性最強。近年來,我國黃曲黴毒素汙染事件頻繁發生,因此,建立高效、通用、靈敏的相關檢測方法,對企業生產,消費者安全都有十分重要的意義。

目前,國內外對黃曲黴毒素的檢測方法主要有高效液相色譜法[6-7]、液相色譜-串聯質譜法[8-9]或液相色譜-高分辨質譜法[10]、免疫學檢測法[11-12]。高效液相色譜法操作煩瑣,盡管檢測器靈敏度高,但雜質多,分析時間較長,免疫學檢測法雖然能大批量檢測,但易與類似結構的化合物發生反應,出現假陽性,結果偏差較大。質譜法應用較廣,前處理簡單,定性定量能力好,但高分辨質譜價格昂貴,難以廣泛應用。本文以分散液液微萃取為前處理手段,建立了液相色譜-串聯質譜法對茶飲料中的黃曲黴毒素B1和B2進行測定。方法學驗證結果表明,方法整體方便快捷,靈敏度高,回收率好,可日常大批量檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

API4000Q質譜儀、島津LC-20AD液相色譜係統、4k-15離心機、IKA Vortex4渦旋混勻器、Milli-Q Advantage A10 超純水係統。

1.2 材料與試劑

茶飲料,廣州市售;黃曲黴毒素B1、黃曲黴毒素B2,純度大於98%,德國Dr.Ehrenstorfer公司;甲酸、乙腈、3-氯苯胺、三氯甲烷,均為HPLC級,美國Thermo Fisher公司;鹽酸、磷酸鈉,均為分析純,廣州試劑廠;實驗用水為Milli-Q超純水。

1.3 樣品前處理

於15 mL尖底離心管中加入1 mL 2 mol/L的鹽酸溶液和50 μL 3-氯苯胺充分混勻,然後加入5 mL樣品,渦旋提取10 min,使用1 mol/L的磷酸鈉溶液調節pH至6,渦旋混勻後置於離心機中以4 500 r/min離心5 min,使3-氯苯胺沉澱。除去上層水相,下層3-氯苯胺用乙腈定容至

200 μL,待測定。

1.4 標準曲線的繪製

標準儲備溶液:分別準確稱取黃曲黴毒素B1和黃曲黴毒素B2標準品各0.050 0 g於100 mL棕色具塞容量瓶中,用乙腈稀釋成500 mg/L的儲備液。

標準中間溶液:用乙腈將上述儲備液稀釋成濃度為

10 mg/L的標準中間液。

溶劑曲線:使用乙腈配製成1.0 µg/L、2.0 µg/L、5.0 µg/L、10 µg/L、20 µg/L、50 µg/L和100 µg/L的標準使用液,繪製校準曲線。

基質曲線:使用空白烏龍茶基質液配製校準曲線,濃度點與溶劑曲線相同。

1.5 色譜及質譜條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱:Xbridge BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,

3.0 µm);進樣體積:10 µL;流速0.5 mL/min;柱溫:35 ℃;流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸(B);等度洗脫程序:0.0~

5.0 min,75% A。

1.5.2 質譜條件

離子源:ESI源;離子化模式:電噴霧電離源正模式(ESI+);氣簾氣壓:241 kPa;毛細管電壓:5 500 V;離子源溫度(TEM):550 ℃;霧化氣壓力:345 kPa;加熱輔助氣壓力:345 kPa;碰撞氣(CAD):中等;采集模式:多反應監測(MRM)模式。

2 結果與分析

2.1 定性定量分析依據的收集

根據黃曲黴毒素B1和黃曲黴毒素B2的化學結構,其含有較多含O基團,在離子化過程中傾向於得到質子,因此分別以其相對分子質量加上H+質量,初步確定母離子質荷比。以混合流動相的流動注射的方式向離子源注射標準溶液,在/ 313.1和/ 315.1處,均得到較高響應的[M+H]+離子,同時以多反應監測(MRM)模式采集二級碎片。進一步優化去簇電壓DP和碰撞電壓CE,得到較優響應,二級質譜圖見圖1,詳細質譜信息見表1。

2.2 分散劑的選擇

分散液液微萃取過程中,加入分散劑和待測樣液互溶,加入萃取劑振蕩形成微小的液滴,這些液滴在移動的過程中於對目標物進行連續萃取,形成水/分散劑/萃取劑形成均相乳濁液體係,快速完成分析物在水溶液與萃取劑之間的分配平衡。選擇鹽酸作為分散劑。在本實驗中,當分散劑用量小於0.6 mL時,提取回收率低於70%,使用量為1.0 mL時,回收率達到最高,隨著使用量提高至1.2 mL,回收率有所回降。所以鹽酸分散劑用量選取為1.0 mL。詳細結果見

2.3 萃取劑體積的選擇

在分散劑體積為1 mL的條件下,分別用30 μL、

50 μL、70 μL、90 μL、110 μL和130 μL的3-氯苯胺進行萃取,考察了不同體積的萃取劑對萃取回收率的影響,結果如圖3所示。隨著3-氯苯胺體積增大,回收率也增大,而當體積大於50 μL時,回收率增大不明顯,而且3-氯苯胺的使用體積越大,pH回調的幅度也越大,實驗更耗時,最終定容液3-氯苯胺的占比也越大,對於含有甲酸的流動相體係,容易造成溶劑效應,使峰型變差。因此,最終確定3-氯苯胺50 μL為最佳萃取體積。

2.4 基質效應的探討

市售的茶飲料會添加糖、色素、酸度調節劑或其他添加劑,且含量遠超於黃曲黴毒素可能存在的含量,加上茶葉本身含有較多的天然物,因此有可能造成較嚴重的基質效應(ME),使定量結果偏差較大。為了探究實驗實際存在的基質效應,分別用空白基質液和乙腈配製了基質曲線和純溶劑曲線,並以基質曲線和純溶劑曲線的斜率比值為判斷依據,當ME在80%~120%時,則說明基質效應不明顯。實驗結果顯示,黃曲黴毒素B1和黃曲黴毒素B2的值分別為23.2%和26.5%,說明基質負效應明顯,因此最終選擇使用基質曲線進行定量,以校正基質效應造成的偏差。

2.5 定量分析結果

使用空白基質溶液配製標準曲線,線性範圍為1.0~100 µg/L,將該曲線於優化後的條件下測定,以質量濃度(X)為橫坐標,峰麵積(Y)為縱坐標,繪製標準曲線。同時以信噪比/=3和信噪比/=10分別確定方法的檢測限與定量限。黃曲黴毒素B1和黃曲黴毒素B2定量離子流圖見圖4。

結果表明,黃曲黴毒素B1和黃曲黴毒素B2的相關係數分別為0.999 6和0.999 3,基質曲線方程分別為=5 050+

2 240和=3 090+2 750,檢測限均為20.0 ng/kg,定量限均為50.0 ng/kg。由分析結果可知,本方法定量能力好,檢出限低,可有效對茶飲料中的黃曲黴毒素進行定量分析。

2.6 回收率及精密度分析

分別對市售的3種茶飲料(綠茶、烏龍茶、紅茶)進行測定,結果均為陰性。使用該樣品進行加標回收實驗。每種樣品均按照定量限的1倍、2倍和10倍進行添加,即0.05 μg/kg、

0.10 μg/kg、0.50 μg/kg濃度水平,每個濃度水平在日內平均測定6次,平均回收率和相對標準偏差結果見表2。

3種樣品的平均回收率範圍在71.2%~91.0%,範圍在2.23%~6.43%,方法回收率、精密度及準確度良好,可用於實際樣品的測定。

3 結論

以液液微萃取為基礎,建立前處理方法,方法整體高效簡單,通過調節pH,較大限度回收萃取劑,提高了回收率;建立UPLC-MS/MS法,優化了色譜及質譜條件,兩種黃曲黴毒素在樣3 min內出峰,且峰型良好。使用基質曲線對定量結果進行校準,降低了基質效應對結果的影響。回收率和相對標準偏差數據表明,方法靈敏度高、重現性好,可為茶飲料中毒素測定方法的開發提供

依據。

參考文獻

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作者簡介:陳佩佩(1990—),女,廣東茂名人,大專,助理工程師。研究方向:食品分析檢測。

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