固相萃取-高效液相色譜-二極管陣列檢測法測定飲料中9種人工合成著

固相萃取-高效液相色譜-二極管陣列檢測法測定飲料中9種人工合成著色劑

□ 汪強 黃宇 張月鬆 趙嵩 馬鞍山市食品藥品檢驗中心

摘　要：本文介紹了使用固相萃取-高效液相色譜-二極管陣列檢測技術來簡便快捷地檢測飲料中檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、赤蘚紅這9種人工合成著色劑含量的方法。樣品經PWAX固相萃取柱淨化，采用串聯兩根Thermo BDS C18色譜柱(4.6×150mm，5μm)，以甲醇和0.02mol/L乙酸銨溶液為流動相進行梯度洗脫，DAD檢測波長為254nm，以保留時間和待測物的紫外吸收光譜進行定性分析、外標法進行定量分析。結果顯示，9種人工合成著色劑的線性範圍為0.5~50mg/L(r2>0.999)，檢出限為0.11~0.39mg/kg，平均回收率為81.5%~102.2%，相對標準偏差為0.23%~2.24%。結論為，該方法可實現對飲料中9種合成著色劑的同時檢測，具有快捷、準確、靈敏的特點。

關鍵詞：固相萃取 高效液相 人工合成著色劑 飲料

在現代食品工業中，各種食品添加劑被頻繁使用。其中，人工合成著色劑具有色澤鮮豔、著色能力強、性質穩定、價格低廉等特點，因而在各式飲料、糕點等的配料表中頻頻“曝光”。殊不知，五彩斑斕的人工合成著色劑主要以苯、甲苯、萘等芳香族化工產品為主要原料，經過磺化、鹵化、偶氮化等有機反應合成而來，過量攝入人工合成著色劑會對人體造成損害[1-3]。因此，《世界杯賽程預測國家標準 食品添加劑使用標準》(GB 2760-2014)[4]中對檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、赤蘚紅這9種人工合成著色劑的使用範圍及最大使用量作出了明確規定。為了避免企業超量使用或超範圍使用人工合成著色劑，故需要通過簡單、快捷的檢測手段對市場上流通的產品進行監管。

目前，人工合成著色劑的檢測方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯用法、薄層色譜法、毛細管電泳法等[5-9]。其中，高效液相色譜法由於儀器保有量大、靈敏度高、操作簡單等特點而被廣泛應用。GB 5009.35-2016[10]、GB 5009.141-2016[11]及SN/T 1743-2006[12]中規定的食品中合成著色劑檢測方法均為高效液相色譜法，但其前處理方法都是聚酰胺吸附法或液-液分配法——操作複雜、消耗試劑多。因此，本試驗采用PWAX固相萃取小柱[13]對飲料進行前處理，使用高效液相色譜-二極管陣列檢測器於254nm波長下同時測定檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、赤蘚紅這9種人工合成著色劑。該方法能夠顯著提高檢測效率，降低成本。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀(配DAD檢測器)，島津(日本);24位固相萃取裝置，安譜(中國);ME204/02型萬分之一天平,梅特勒-托利多(瑞士);12位N-EVAP 5085型氮吹儀，organomation(美國);Arium-Pro型純水係統，賽多利斯(德國);S-700B型多參數測試儀,梅特勒-托利多(瑞士)，Cleanert PWAX(150mg/6mL)，Agela(中國);0.45μm水洗微孔濾膜，CNW(德國)，HC-3018型離心機，中科中佳(中國)。

1.1.2 試劑

檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、赤蘚紅這9種著色劑標準物質，均由德國Dr.Ehrenstorfer公司提供，並於20±4℃下保存。

甲醇(色譜純)，TEDIA;乙酸銨(色譜純)，阿拉丁;氨水(分析純)、檸檬酸(分析純)、硫酸鋅(分析純)，國藥;實驗室用水均為超純水。

乙酸銨溶液(0.02mol/L)：稱取1.54g乙酸銨，加水溶解並稀釋至1000mL。

檸檬酸溶液(200g/L)：稱取20g檸檬酸，加水定容至100mL溶解，混勻。

硫酸鋅溶液(120g/L)：稱取12g硫酸鋅，加水定容至100mL溶解，混勻。

2%氨化甲醇：量取2mL氨水，加甲醇定容至100mL，混勻。

水(pH值6.0)：水加檸檬酸溶液調節至pH值6.0。

檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、赤蘚紅標準混合儲備液(1mg/mL)：分別稱取適量的9種著色劑置於燒杯中，用少許水(pH值6.0)溶解，轉移至100mL容量瓶中，並用水(pH值6.0)定容至刻度，混勻。

1.2 色譜條件

兩根串聯的Thermo BDS C18色譜柱(4.6×150mm，5μm);柱溫：35℃;流量：1.0mL/min;進樣量：50μL;檢測波長：254nm;流動相A：0.02mol/L乙酸銨溶液，流動相B：甲醇;梯度洗脫程序見表1。

1.3 實驗方法

1.3.1 不含蛋白質的樣品

稱取10g樣品放入100mL燒杯中(含二氧化碳的樣品超聲去除二氧化碳)，用檸檬酸溶解調節pH值至6.0，然後加入到分別用8mL甲醇、8mL水(pH值6.0)進行活化的PWAX小柱中。燒杯用適量的水衝洗後一起加入至PWAX小柱，再用6mL水(pH值6.0)、6mL甲醇淋洗，之後通入空氣吹幹小柱6min。最後，用8mL 2%氨化甲醇洗脫並接收，收集液於50℃氮氣吹幹，用5mL水(pH值6.0)定容，過0.45μm水係微孔濾膜，待測。

1.3.2 含蛋白質的樣品

稱取10g樣品放入50mL離心管中，加入5mL硫酸鋅溶液(120g/L)，用檸檬酸溶解調節pH值至6.0，在10000r/min下離心5min，取上清液於幹淨的50mL離心管中。殘渣中加入5mL水(pH值6.0)渦旋振蕩提取5min，在10000r/min下離心，取上清液合並至上述幹淨的50mL離心管中。將合並後的上清液加入至分別用8mL甲醇、8mL水(pH值6.0)進行活化的PWAX小柱中，再用6mL水(pH值6.0)、6mL甲醇淋洗，之後通入空氣吹幹小柱6min。最後，用8mL 2%氨化甲醇洗脫並接收，收集液於50℃氮氣吹幹，用5mL水(pH值6.0)定容，過0.45μm水係微孔濾膜，待測。

2 結果與討論

2.1 淨化方法的改進

《世界杯賽程預測國家標準 食品中合成著色劑的測定》(GB 5009.35-2016)[10]規定，同時測定赤蘚紅含量時需要使用液-液分配法，但該方法不僅操作步驟繁瑣，且使用的試劑量較多、對環境危害大。所以本文選用PWAX小柱代替原有國標的測試方法，不僅簡化了操作步驟，還減少了汙染，更可同時檢測9種著色劑。

2.2 流動相的改進

流動相的選擇參考國標《世界杯賽程預測 國家標準 食品中合成著色劑的測定》(GB 5009.35-2016)[10]方法，采用甲醇和0.02mol/L乙酸銨的混合體係，優化梯度洗脫條件以縮短9種著色劑的檢測時間，並獲得了較好的分離效果，梯度洗脫程序見表1。

2.3 色譜柱的改進

當前，市麵上C18色譜柱的常見規格為(4.6×150mm，5μm)和(4.6×250mm，5μm)兩種。在優化後的色譜條件下，對比市麵上兩種常見規格C18色譜柱的分離效果發現，檸檬黃和新紅這兩種著色劑的分離效果並不理想。為了能將這兩種著色劑完全分離，於是根據增加柱長可以提高分離效果的原理，將兩根規格(4.6mm×150mm，5μm)的C18色譜柱通過管路連接起來形成一根規格類似為(4.6mm×300mm，5μm)的C18色譜柱，再使用優化後的色譜條件分離9種著色劑，發現9種色素均能夠完全分離，見圖1。因此，選擇串聯相同規格色譜柱作為分離目標化合物的新方法。

2.4 檢測波長的選擇

在檢測多種著色劑時，很多文章報道是通過在不同著色劑的出峰時間段內設置其最大吸收波長的方式來進行檢測。這種方式雖然可以增加檢測的靈敏度，但由於不斷的改變波長造成在檢測低濃度時基線波動較大，使檢測數據不準確。因此，本文選擇使用254nm作為9種著色劑的檢測波長。此外，為了提升檢測靈敏度，本文通過增加進樣量的方式來改善這一問題。

2.5 工作曲線和檢出限

按照實驗方法對不同濃度標準係列溶液進行測定，以9種著色劑的質量濃度為橫坐標，與其對應的峰麵積為縱坐標繪製工作曲線。結果表明，9種著色劑的質量濃度均在0.5~50mg/L內，與其對應的峰麵積之間呈線性關係，線性回歸方程及相關係數見表2。

將混標添加在空白基質樣品中，在相同條件下進行6次平行試驗，按照3倍信噪比考察了9種著色劑的檢出限，具體結果見表2。

2.6 回收試驗

分別稱取可樂、葡萄汁、橙汁、咖啡這4種陰性樣品10.00g，按照實驗方法對其進行不同濃度水平的加標回收試驗，每一個濃度平行進行6次試驗，計算回收率，結果見表3。

3 結果與討論

本文建立了采用PWAX固相萃取小柱對飲料進行前處理，使用高效液相色譜-二極管陣列檢測器於254nm波長下同時測定檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、赤蘚紅這9種人工合成著色劑的方法。該方法操作簡便、基體幹擾小，優化後的色譜條件出峰快、峰形好，分離度符合要求，適合飲料產品中著色劑的定性和定量分析。

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