一種檢測鹽黴素膠體金試紙條的研製及其應用

□ 黃寶兵 大同市綜合檢驗檢測中心

摘　要：本研究應用鹽黴素單克隆抗體研製出一種能夠檢測動物源性食品中鹽黴素的膠體金免疫層析試紙條，檢測限為20μg/kg，檢測時間僅為15min，假陽性率和假陰性率均為0，符合《獸藥殘留檢測試劑盒(條、卡)備案技術資料要求及審查工作程序》的要求。該試紙條能夠應用於基層實驗室的大批量樣本檢測，具有實際意義，並且未見免疫方法相關文獻報道，具有創新性。

關鍵詞：鹽黴素 膠體金免疫層析試紙條 快速檢測

引言

鹽黴素屬於聚醚類抗生素，不僅常用於防治雞、豬等畜禽的球蟲病，還能作為豬等家畜的生長促進劑。為牟取更高收益，不良畜牧業主會過量使用鹽黴素，導致動物源性食品中的鹽黴素超標，進而影響人類健康。因此，檢測動物源性食品中的鹽黴素具有必要性。目前，檢測鹽黴素的方法主要有高效液相色譜柱後衍生化法、UPLC-MS/MS法、液相色譜-電噴霧串聯質譜法等儀器方法[1-6]，但鮮有快速檢測方法。上述儀器檢測方法耗時較長，單台儀器成本在百萬元以上，難以用於基礎實驗室的檢測工作。膠體金免疫層析試紙條屬於快速檢測方法，檢測時間小於30min，試紙條成本幾元至幾十元不等，非常適合基層實驗室的大批量檢測工作。本研究開發了一種檢測鹽黴素的膠體金免疫層析試紙條，其能夠檢測動物源性食品中的鹽黴素抗生素殘留，實際應用價值較高。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹽黴素、馬杜黴素、紅黴素、泰樂菌素、莫能菌素等標準品(純度≥95%)，購自北京標準物質研究中心;氯金酸(HAuCl4·3H2O)，購自美國Sigma公司;檸檬酸三鈉，購自北京百欣試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 膠體金的製備

取0.01%氯金酸水溶液100mL加熱至沸騰;一邊攪拌，一邊準確加入1%檸檬酸三鈉溶液1.5mL;待氯金酸水溶液變為酒紅色，繼續煮沸15min，冷卻後於4℃避光保存[7-10]。

1.2.2 鹽黴素單克隆抗體-膠體金標記物的製備

在磁力攪拌下，用0.2mol/L Na2CO3溶液調節膠體金溶液的pH值至7.2，每毫升膠體金溶液中加入50μg鹽黴素單克隆抗體，混勻，靜置10min，加入10%BSA，使其在膠體金溶液中的體積百分含量為1%，靜置10min。然後離心、洗滌、重懸，置於4℃備用[7-10]。

1.2.3 結合物釋放墊的製備

將結合物釋放墊浸泡於含有牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩衝液中的濃度為0.5%)、pH值7.2、0.5mol/L的磷酸鹽緩衝液中，均勻浸濕1h，37℃烘3h備用。用Isoflow點膜儀將製備好的鹽黴素單克隆抗體-膠體金標記物均勻噴塗在結合物釋放墊上，每1cm結合物釋放墊噴塗0.01mL鹽黴素單克隆抗體-膠體金標記物後，置於37℃環境中(濕度<20%)60min後取出，置於幹燥環境(濕度<20%)中保存備用[7-10]。

1.2.4 反應膜的製備

將鹽黴素包被原包被到反應膜上構成檢測線，將羊抗鼠抗抗體包被在反應膜上構成質控線[7-10]。

包被過程：用磷酸緩衝液將鹽黴素包被原稀釋至10mg/mL，用Isoflow點膜儀將其包被於硝酸纖維素膜上的檢測線(T線)，包被量為0.8μL/cm;用0.01mol/L、pH值7.4的磷酸鹽緩衝液將羊抗鼠抗抗體稀釋到200μg/mL，用Isoflow點膜儀將其包被於硝酸纖維素膜上的質控線(C線)，包被量為1.0μL/cm。將包被好的反應膜置於37℃條件下幹燥2h，備用[7-10]。

1.2.5 樣品吸收墊的製備

將樣品吸收墊置於含0.5%牛血清白蛋白(體積分數)、pH值7.2、0.1mol/L的磷酸鹽緩衝液中浸泡2h，37℃烘2h，備用[7-10]。

1.2.6 檢測方法

用吸管吸取70μL待檢樣品溶液垂直滴加於加樣孔中，液體流動時開始計時，反應5~10min，根據示意圖判定結果或通過膠體金分析儀讀取檢測結果，其它時間判讀無效[7-10]。

1.2.7 樣本檢測限

在空白雞肉、豬肉等動物源性食品樣本中分別添加鹽黴素標準品至質量濃度為0、10、15、20、25、30μg/L，按照“1.2.6”所述方法用3批試紙條進行檢測，每個濃度重複5次，根據實驗結果確定樣本檢測限[9-10]。

1.2.8 試紙條的特異性

分別配製500μg/L的馬杜黴素、紅黴素、泰樂菌素、莫能菌素等藥物，用該試紙條檢測，重複3次，判斷試紙條的特異性。

1.2.9 試紙條的準確性

農業部文件要求，以假陽性率和假陰性率表示膠體金免疫層析法的準確性。取經儀器確證的50份陰性雞肉、豬肉等動物源性食品樣品(質量濃度小於20μg/kg)，50份陽性雞肉、豬肉等動物源性食品樣品(質量濃度大於20μg/kg)，然後用該試紙條進行鹽黴素藥物殘留檢測，計算假陽性率和假陰性率。《獸藥殘留檢測試劑盒(條、卡)備案技術資料要求及審查工作程序》規定：試紙條假陽性率應小於5%，假陰性率應為零[9-10]。

1.2.10 試紙條的穩定性

將試紙條保存於2~8℃環境中，每隔1個月檢測試紙條的準確性，連續測定15個月。具體方法為：分別檢測經儀器確證的20份陰性雞肉、豬肉動物源性食品樣品(質量濃度小於20μg/kg)，20份陽性雞肉、豬肉動物源性食品樣品(質量濃度大於20μg/kg)，重複測定2次，然後根據實驗結果判定試紙條的穩定性[9-10]。

2 結果與分析

2.1 膠體金的鑒定

肉眼觀察製備的膠體金，其顏色為酒紅色、均勻度較好、無雜質、透明度較高。取冷卻後的膠體金溶液在透射電鏡下觀察膠體金顆粒的均一程度，並測量金顆粒粒徑。經透射電鏡觀察，膠體金顆粒分布比較均勻，金顆粒的粒徑約為20nm[9-10]。

2.2 樣本檢測限

配置鹽黴素濃度分別為0、10、15、20、25、30μg/L的雞肉、豬肉動物源性食品樣品，按照“1.2.7”所述步驟進行檢測，確定檢測限。該試紙條的檢測限為20μg/kg，見表1、圖3、圖4。

2.3 特異性

使用試紙條檢測500μg/L的馬杜黴素、紅黴素、泰樂菌素、莫能菌素等藥物，結果均呈陰性，表明該試紙條特異性較好。

2.4 準確性

用試紙條檢測50份陰性動物源性食品樣品，檢測結果均為陰性，說明假陽性率低於5%;用試紙條檢測50份陽性動物源性食品樣品，試紙條檢測結果均為陽性，說明試紙條假陰性率為零，符合《獸藥殘留檢測試劑盒(條、卡)備案技術資料要求及審查工作程序》的要求。

2.5 穩定性

12個月內，試紙條的假陽性率和假陰性率均符合要求，從第14個月起，試紙條會出現少量失效或假陽性等現象。

3 討論

目前，有關應用快速檢測方法檢測鹽黴素的文獻非常有限，本文製備出一種商品化的膠體金免疫層析試紙條，並按照《獸藥殘留檢測試劑盒(條、卡)備案技術資料要求及審查工作程序》的要求對試紙條進行了特異性、準確性、穩定性等性能測試，均符合要求。該試紙條的檢測時間僅為15min，比現有文獻中的儀器方法用時更短，操作更簡便;檢測限為20μg/kg，且未見免疫方法相關文獻報道。

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