高效液相色譜法測定綠豆糕中5種常見的食品添加劑

□ 陳磊 馬鞍山市市場監管綜合行政執法支隊
摘　要：本文旨在建立高效液相色譜法同時測定綠豆糕中的安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸，樣品經正己烷去除油脂、硫酸鋅-氫氧化鈉去除蛋白質，然後采用色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），以甲醇和0.02mol/L乙酸銨（pH值8.0）溶液為流動相,按照5∶95的比例進行等度洗脫，DAD檢測波長為230nm，以保留時間和待測物的紫外吸收光譜進行定性分析、外標法進行定量分析。結果顯示，5種食品添加劑的線性範圍為0.5~100mg/L（r2＞0.999），檢出限為0.12~0.64mg/kg，平均回收率為94.0%~99.9%，相對標準偏差為0.72%~1.31%。由此可見，該方法可實現對綠豆糕中5種常見食品添加劑的同時檢測，具有高效、準確、靈敏的特點。
關鍵詞：高效液相色譜 食品添加劑 綠豆糕
隨著人們生活水平的不斷提升，對於 世界杯賽程預測的要求也隨之增高。綠豆糕是百姓家中常備的糕點之一，參照《 世界杯賽程預測國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760-2014）[1]，糕點中可添加的 食品添加劑種類繁多，但市麵上銷售的綠豆糕配料表中常見的添加劑種類為防腐劑和甜味劑。安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸是較為常見的防腐劑和甜味劑種類，由於它們都是人工合成的化學物質，故具有一定的毒性[2-4]。因此，《世界杯賽程預測 國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760-2014）[1]中規定了它們的最大使用量。為了避免企業過量使用食品添加劑，故需要通過簡單、快捷的檢測手段對市場上流通的產品進行監管。
當前，對安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸的檢測多采用高效液相色譜法，且會在樣品前處理中使用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作為沉澱劑[5-8]。通過日常的檢驗過程發現，亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作為沉澱劑會造成樣品中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸這5種食品添加劑在色譜條件下的出峰時間發生改變而造成結果的誤判。因此，本文在測定時選擇更為合適的沉澱劑並對流動相的條件加以優化來消除脫氫乙酸的拖尾現象，從而高效、準確地測定綠豆糕中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸的含量。
1 實驗部分
1.1 儀器與試劑
1.1.1 儀器
U3000型高效液相色譜儀，賽默飛（美國），配DAD檢測器；ME204/02型萬分之一天平，梅特勒-托利多（瑞士）；Arium-Pro型純水係統，賽多利斯（德國）；S-700B型多參數測試儀，梅特勒-托利多（瑞士）；T18型分散機，IKA（德國）；0.22μm水相微孔濾膜，CNW（德國），HC-3018型離心機，中科中佳（中國）。
1.1.2 試劑
安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉，均由德國Dr.Ehrenstorfer公司提供，於20±4℃下保存；脫氫乙酸由美國Chem Service公司提供，於4℃下保存。
甲醇、乙酸、正己烷，均為色譜純，由TEDIA提供；乙酸銨為色譜純，阿拉丁；氨水、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硫酸銅、氫氧化鈉，均為分析純，由國藥提供；實驗室用水均為超純水。
乙酸銨溶液（0.02mol/L，pH值8.0）：稱取乙酸銨1.54g，加水溶解並稀釋至1000mL，用氨水調節pH值至8.0。
硫酸鋅溶液（120g/L）：稱取120g硫酸鋅，加水溶解並稀釋至1000mL。
亞鐵氰化鉀溶液（106g/L）：稱取106g亞鐵氰化鉀，加水溶解並稀釋至1000mL。
乙酸鋅溶液（220g/L）：稱取220g乙酸鋅，加入30mL乙酸，加水溶解並稀釋至1000mL。
硫酸銅溶液（100g/L）：稱取100g硫酸銅，加水溶解並稀釋至1000mL。
氫氧化鈉溶液（20g/L）：稱取20g氫氧化鈉，加水溶解並稀釋至1000mL。
氫氧化鈉溶液（40g/L）：稱取40g氫氧化鈉，加水溶解並稀釋至1000mL。
安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸標準混合儲備液（1mg/mL）：分別稱取適量的5種食品添加劑置於燒杯中，加入10mL氫氧化鈉溶液（20g/L）和適量的水溶解，轉移至100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻。
安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸標準工作液：分別移取適量的安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸標準混合儲備液至10mL容量瓶中，並用水定容至刻度，混勻。

1.2 色譜條件
月旭Ultimate C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；柱溫：35℃；流量：1.0mL/min；進樣量：10μL；檢測波長：230nm；流動相：0.02mol/L乙酸銨溶液（pH值8.0）∶甲醇=95∶5（V∶V）。

1.3 實驗方法
稱取2.0g（精確至0.1mg）樣品置於50mL離心管中，加入20mL純水、2mL硫酸鋅（120g/L）、1.5mL氫氧化鈉（40g/L），勻漿，10000r/min離心5min，取上清液於250mL分液漏鬥中。然後，在殘渣中加入20mL純水，勻漿，10000r/min離心5min，合並上清液於250mL分液漏鬥中。之後，在分液漏鬥中加入15mL正己烷，振蕩5min，靜置分層，取下層溶液於50mL容量瓶中，用水定容至刻度，過0.22μm水相微孔濾膜，待測。

2 結果與討論
2.1 沉澱劑的選擇
目前，在檢測安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸時大多選擇亞鐵氰化鉀-乙酸鋅[9-10]體係作為沉澱劑，其雖然對於蛋白質的沉澱效果明顯，但按照色譜條件進行測試時發現存在使樣品中的5種目標物質出峰時間與標準物質出峰時間不一致的現象。由此推測，可能是亞鐵氰化鉀的配位作用造成5種目標物質的性質發生變化。
本文同時試驗硫酸鋅-氫氧化鈉[11]和硫酸銅-氫氧化鈉[12]兩種體係的沉澱劑，二者對於蛋白質的沉澱均有顯著效果，但由於硫酸銅屬於有毒物質，不利於環保和實驗室安全，故本文最終選擇硫酸鋅-氫氧化鈉體係作為沉澱劑。

2.2 流動相的改進
測定安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸時通常使用0.02moL/L乙酸銨和甲醇為流動相[3-10]，以體積比95∶5進行等度洗脫，以此分離以上5種食品添加劑。在此流動相下分析以上5種食品添加劑不僅耗費時間長，且脫氫乙酸的峰型存在拖尾現象。調節流動相的pH值可以抑製脫氫乙酸水解而造成峰型拖尾的現象，故本文通過氨水調節0.02moL/L乙酸銨的pH值，並比對pH值為5.0、6.0、7.0、8.0時的色譜圖。最後發現，當乙酸銨的pH值為8.0時，5種食品添加劑的分離效果較好，且脫氫乙酸無拖尾現象（如圖1）。

2.3 檢測波長的選擇
利用DAD檢測器分別對安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸進行波長掃描，各組分的最大吸收波長分別為安賽蜜（226nm）、苯甲酸（223nm）、山梨酸（254nm）、糖精鈉（207nm）、脫氫乙酸（230nm）。最終，綜合考慮各組分的響應值，選擇230nm作為最終的檢測波長。

2.4 工作曲線和檢出限
按照實驗方法，對濃度分別為0.5、1、5、10、50、100mg/L的標準係列溶液進行測定，以5種食品添加劑的質量濃度為橫坐標，與其對應的峰麵積為縱坐標繪製工作曲線。結果表明，5種食品添加劑的質量濃度與其對應的峰麵積之間呈線性關係，線性回歸方程和相關係數見表1。

將混標添加在空白基質樣品中，在相同條件下進行6次平行試驗，按照3倍信噪比考察5種食品添加劑的檢出限，具體結果見表1。

2.5 回收試驗
分別稱取綠豆糕陰性樣品2.0g（精確至0.1mg），按照實驗方法對其進行不同濃度水平的加標回收試驗，每一個濃度平行進行6次實驗，計算回收率，結果見表2。

3 結果與討論
本文建立了氫氧化鈉-硫酸鋅體係作為沉澱劑的液-液萃取方法對綠豆糕進行前處理，使用高效液相色譜-DAD檢測器於230nm波長下同時測定安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸這5種食品添加劑。該方法操作簡便、準確度高，優化後的色譜條件出峰快、峰形好，分離度符合要求，適用於綠豆糕中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸這5種食品添加劑的定性和定量分析。

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