芹菜素對人腦膠質瘤細胞凋亡作用的研究
本文主要研究芹菜素對人腦膠質瘤細胞U87凋亡的影響及機製。方法:應用CCK8法檢測細胞增殖抑製率。流式細胞術檢測細胞周期。Western-blot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2及Bax的表達。結果:①芹菜素能抑製膠質瘤細胞U87的增殖。②不同濃度的芹菜素作用24h,G2期細胞所占比例呈下降趨勢。③芹菜素處理組的細胞,Bcl-2蛋白的表達量隨著芹菜素濃度的增加而降低,Bax蛋白的表達量則隨芹菜素濃度的增加而升高。結論:芹菜素能抑製膠質瘤細胞U87的增殖,並可能通過線粒體信號途徑誘導其凋亡。
膠質瘤(glioma)是最常見的惡性程度極高的中樞神經係統腫瘤,占顱內惡性腫瘤的78%左右[1]。膠質瘤起源於神經係統膠質細胞和神經元細胞,是一類高度血管化的腫瘤,具有彌漫性浸潤性生長、侵襲性強、易複發、難切除、預後差[2,3]等特點, 其中位生存期隻有一年左右[4-6]。在全身性惡性腫瘤中,惡性膠質瘤5年病死率緊隨胰腺癌和肺癌之後,位居第3位[7,8]。
芹菜素是一種天然的黃酮類化合物[9],低毒,無誘變性[10],抗癌譜廣,是抗腫瘤藥研究的熱點之一,但其對膠質瘤的確切作用及機製尚缺乏係統研究。本研究采用芹菜素對人腦膠質瘤細胞係U87進行體外幹預,以研究芹菜素對膠質瘤細胞凋亡的影響及機製。
材料與方法
實驗細胞係
選擇人腦膠質瘤細胞係U87作為研究對象,購於北納生物有限公司。
主要試劑
芹菜素和RIPA細胞裂解液購於北京索萊寶科技有限公司;DMEM完全培養液(1×)和CCK8法細胞增殖檢測試劑盒購於江蘇凱基生物技術股份有限公司;兔抗人Bcl-2、兔抗人Bax抗體、GAPDH均為美國CST公司產品;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG為上海碧雲天生物技術有限公司產品;PVDF膜為Millipore公司產品。
方法
芹菜素工作液的製備 原芹菜素濃度是10mmol/mL,需配製成20umol/L、40umol/L和80umol/L。將原芹菜素稀釋1000倍即得到濃度為10umol/mL的芹菜素濃度。依次將2uL、4uL和8uL芹菜素溶解在1mL相應培養基中即可得到所需的實驗濃度。
細胞培養 將人腦膠質瘤細胞U87置於含有10%胎牛血清、0.2%NaHCO3、0.3%HEPES 的DMEM培養基中,置於37℃、5%CO2 的恒濕孵箱中進行培養。每天觀察細胞生長情況,由於各細胞生長周期不同,每2天換次培養液,3~5天用0.25%的胰酶消化傳代一次,取對數生長期細胞(即培養瓶底布滿80%時)進行實驗。
實驗分組 實驗共分5組:芹菜素低濃度組(20 umol/L)、芹菜素中濃度組(40 umol/L)、芹菜素高濃度組(80 umol/L)、空白對照組(隻加培養基)和陰性對照組(DMSO+培養基)。處理24h後收集所需細胞進行檢測。
CCK8法檢測芹菜素對U87細胞增殖的影響
對細胞鋪板於96孔板貼壁後細胞換液,每孔100ul;每孔加入10ul CCK8試劑,按 20umol/L、40umol/L、80 umol/L濃度梯度設定的芹菜素工作液,分別處理實驗組細胞,置於培養箱中孵育2h;酶標儀在450nm波長下,測吸光度(OD)值。同等條件下重複實驗三次,計算腫瘤細胞的存活率。腫瘤細胞存活率(%)=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。
流式細胞術檢測細胞周期
用20umol/L、40umol/L、80 umol/L濃度芹菜素工作液處理U87細胞,培養24h,胰酶消化,PBS洗滌2次,離心,70%乙醇4℃固定過夜,PBS洗滌2次,離心,碘化丙啶染色,室溫避光孵育30分鍾。500ul PBS重懸細胞,流式細胞儀檢測細胞周期變化。
Western-blot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達
用20umol/L、40umol/L、80 umol/L濃度芹菜素工作液處理U87細胞,24h後,收集細胞,3000r/min離心10min後,冰PBS衝洗,加入細胞裂解液,冰上裂解30min後,4℃,10000r/min離心10 min,小心吸取上清,獲得總蛋白並測定蛋白濃度。蛋白變性,上樣,經十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳1~2h,後濕法轉膜30~50min。加入GAPDH一抗(1:1000)、Bcl-2一抗(1:1000)、Bax一抗(1:1000)孵育,4℃過夜;加入山羊抗兔二抗(1:2000)室溫孵育1~2h。在膜上滴加電化學發光(ECL)顯色液,在凝膠成像係統下成像並測定條帶灰度值。
統計學方法
采用SPSS 19.0統計軟件包處理數據。計量數據用均數±標準差(mean±SD)表示。各項參數值之間的比較分別采用t檢驗和χ2檢驗,以P <0.05為差異有統計學意義。
結果
芹菜素對膠質瘤細胞U87增殖的影響
CCK8法檢測結果顯示芹菜素對膠質瘤細胞U87具有增殖抑製作用。與對照組比較,不同濃度的芹菜素工作液處理24h後,細胞生存率下降,細胞生長明顯受抑製;並且隨著芹菜素濃度的增高,抑製細胞增殖的效果越明顯(圖1)。
流式細胞術檢測細胞周期結果
分別用20umol/L、40umol/L、80 umol/L的芹菜素工作液處理U87細胞24h後,細胞周期各時相所占的比例不相同。隨芹菜素濃度的增加,G2期細胞所占比例呈下降趨勢。但20umol/L和40umol/L的芹菜素抑製細胞增殖的作用不明顯;芹菜素工作濃度增加至80umol/L時,則能明顯抑製細胞的增殖(圖2)。
凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達
分別用20umol/L、40umol/L、80 umol/L的芹菜素工作液處理U87細胞24h後,檢測凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達。隨芹菜素濃度的增加,Bcl-2蛋白的表達量呈下降趨勢,Bax蛋白的表達量呈上升趨勢(圖3)。
討論
近年來,天然植物提取物單體以其對正常細胞毒性小,對惡性腫瘤細胞毒性大和促凋亡而備受青睞。
芹菜素,又稱芹黃素,是一種天然的黃酮類化合物,廣泛存在於自然界中,以植物黃色素的形式在茶葉、蔬菜、水果、豆類和香料中廣泛分布,中藥如地錢、西藏雪蓮花、車前子、絡石藤等中也有很高的含量,其中以芹菜根的含量最為豐富,目前已經可以人工合成。通過大量研究發現芹菜素具有抗腫瘤、抗突變、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗焦慮、保護心血管、保護中樞神經等多種生物活性,其中其抗腫瘤作用最為突出,並且與其他黃酮類物質( 如槲皮素、山奈黃酮等) 相比,具有低毒性及無誘變性等優點[10]。
芹菜素抗腫瘤作用[11-12]的主要機製有:(1)調控細胞周期運行,抑製腫瘤細胞增殖;(2)誘導腫瘤細胞凋亡;(3)幹擾腫瘤細胞信號傳導;(4)抑製腫瘤血管生成、侵襲和轉移。孫悅等[13-14]的研究表明,芹菜素可誘導胃癌細胞凋亡,並且誘導胃癌細胞凋亡的作用呈現藥物濃度依賴性,同時證明芹菜素誘導胃癌細胞凋亡的機製主要是通過Bcl-2/Bax-Caspase-3、Caspase-9的線粒體凋亡通路活化實現的。SHUKLA等[15]研究發現,芹菜素可通過誘導前列腺癌細胞周期阻滯於G2/M期,從而有效抑製前列腺癌細胞的增殖,抑製作用表現出現藥物濃度依賴性。
本研究中,CKK8法檢測結果顯示,芹菜素能抑製膠質瘤細胞U87的增殖;並且隨著芹菜素濃度的增加,對瘤細胞增殖抑製的作用也越明顯,與貢偉一等[16]的研究結果一致。流式細胞術檢測細胞周期的結果顯示,高濃度的芹菜素可明顯減少膠質瘤細胞G2期的細胞數目,提示芹菜素可調控細胞周期的運行,從而抑製腫瘤細胞的增殖能力。在隨後進行的凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax蛋白表達的研究中,我們的結果顯示芹菜素能夠上調Bax蛋白的表達,而Bcl-2蛋白的表達則降低;並且隨著芹菜素濃度的增加,Bax蛋白的表達量呈上升趨勢,Bcl-2蛋白的表達量則呈下降趨勢,提示芹菜素可通過調控凋亡基因、調節參與凋亡的蛋白的表達等方式誘導腫瘤細胞凋亡。此外,不同濃度的芹菜素處理膠質瘤細胞24h後,Bcl-2/Bax比值逐漸降低,我們推測芹菜素可能是通過降低Bcl-2/Bax比值,誘導線粒體依賴的凋亡途徑,從而實現其誘導膠質瘤細胞的目的。
綜上所述,本研究通過研究芹菜素對人腦膠質瘤細胞凋亡的影響,探討芹菜素抗膠質瘤作用的可能機製,以期為中西醫結合治療膠質瘤提供新的思路和方法。
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作者簡介:曲曉媛 碩士,副教授。研究方向:腫瘤病理學。
基金項目:山東省中醫藥科技發展計劃項目“芹菜素對人腦膠質瘤細胞U87、U251體外抗腫瘤作用的實驗研究”(編號:2015-200)。
曲曉媛1 盧強 1 賈世磊 2
1.山東中醫藥高等專科學校免病教研室
2.山東省煙台護士學校臨床教學部