基於銀沉積的微間隙陣列電極檢測鹽酸克倫特羅的方法研究

摘 要：本文旨在建立一種基於酶催化銀沉積的微間隙陣列電極的鹽酸克倫特羅檢測方法，采用微間隙陣列電極作為基礎電極，將競爭性酶聯免疫反應與酶催化銀沉澱信號放大技術相結合，建立了低濃度鹽酸克倫特羅檢測的微間隙陣列電極分析方法。該方法通過共價固定BSA結合抗原，經過競爭性免疫反應，捕獲堿性磷酸酶結合抗體並催化銀沉積。結果顯示，鹽酸克倫特羅濃度與電導率呈負相關。當鹽酸克倫特羅濃度在100μg/L~100pg/L範圍內時，鹽酸克倫特羅濃度的對數值與檢測電導率之間呈良好的線性關係，線性相關係數為0.9978，檢出限為100pg/L，豬肉加標樣品回收率在80%以上。故該方法具有靈敏度高、響應快、成本低、操作方便等優點，為鹽酸克倫特羅等小分子的快速檢測提供了一種有效手段。
關鍵詞：微間隙陣列電極 銀沉積 競爭性免疫反應
鹽酸克倫特羅（Clenbuterol hydrochloride，Clen）是一種β2-腎上腺素受體激動劑，主要用於治療哮喘和肺部疾病。此外，它還具有提升脂肪轉化和分解的能力，從而加速動物生長並產生更多的肌肉。因此，Clen會被非法用於飼養動物以增加其瘦肉比例。動物過量攝入此類藥物會導致急性中毒，出現肌肉震顫、心悸、頭暈等症狀，雖然世界衛生組織已禁止在動物飼料中添加Clen，但未能阻止其濫用。因此，Clen的檢測在國內外引起了極大關注。目前，已開發出多種Clen檢測分析技術，包括高效液相色譜法（HPLC）[1]、液相色譜-質譜法（LC-MS）[2]、氣相色譜-質譜法（GC-MS）[3]、酶聯免疫吸附測定法（Elisa）[4]、膠體金免疫檢測試紙條法和電化學測定方法[5]等。其中，高效液相色譜法、氣相色譜-質譜法和液相色譜-質譜法都存在需要大型儀器設備、成本高、處理時間長等缺點；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）對影響因素的要求相對嚴格，如溫度、pH值等；膠體金法雖然成本低、檢測時間短、操作簡便，但靈敏度不高，難以準確定量。與以上方法相比，電化學分析不僅具有響應快、成本低、操作方便等優點，還運用了級聯酶放大技術以及基於納米材料、核酸的信號放大技術，顯著提高了檢測靈敏度，故成為一種很好的選擇。
本研究采用微間隙陣列電極芯片，基於酶聯免疫競爭法結合酶催化銀沉積信號放大係統，進而實現對鹽酸克倫特羅的有效檢測。本方法具有檢測速度快、操作簡便、無需大型儀器設備等優點，能應用於肉製品中鹽酸克倫特羅的檢測。
1 材料與方法
1.1 試劑與儀器
1.1.1 試劑
鹽酸克倫特羅與牛血清白蛋白的偶聯物（Clen-BSA）、鹽酸克倫特羅單克隆抗體（mAb），湖南遠泰生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）標記羊抗小鼠IgG，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；抗壞血酸磷酸酯（ascorbic acid phosphatase，AAP），sigma公司；AgNO3、甘氨酸，購自國藥集團化學試劑有限公司；其他化學試劑均為分析純；PBS緩衝液（0.01mol/L，pH值7.4）、PBST洗滌液【於PBS緩衝液中加入0.05%（V/V）的Tween-20】、包被液（0.05mol/L，pH值9.6的碳酸鹽緩衝液）、封閉液（1%BSA）。
1.1.2 儀器
數顯恒溫器（LRH-250F），上海一恒科技有限公司；電化學工作站（CHI760D），上海辰華儀器公司；微間隙陣列電極芯片為本實驗室設計。

1.2 試驗方法
微間隙陣列電極芯片用無水乙醇清洗3次，再用超純水清洗後晾幹；使用濃度為1μg/mL的Clen-BSA包被；加入200μL封閉液，在37℃恒溫孵育1h，PBST洗滌3次；加入鹽酸克倫特羅單克隆抗體和樣品提取液的混合液，37℃孵育1h，PBST洗滌3次；加入100μL AP標記羊抗小鼠IgG，37℃孵育30min，洗板3次；加入100μL底物溶液【采用滅菌的0.1mol/L甘氨酸-NaOH溶液（pH值9.0）配製的1mmol/L AAP和5mmol/LAgNO3】，混勻，37℃避光孵育10min，用超純水清洗3次。運用電化學工作站，在0~50mV點位範圍內采用線性掃描伏安法檢測。

1.3 ELISA方法
加入酶聯抗體之前的步驟與微間隙陣列電極分析相同。酶聯免疫分析采用辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG，用PBST洗滌3次後，加入100μL TMB溶液，37℃避光孵育15分鍾。然後加入2mol/L H2SO4終止反應，在450nm處測量吸光度。

1.4 靈敏度分析
使用微間隙陣列電極法對一係列濃度梯度（100μg/L、1μg/L、10ng/L、100pg/L）的鹽酸克倫特羅溶液進行檢測，確定方法的靈敏度。

1.5 特異性分析
將鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林作為待測樣品，進行特異性分析。

2 結果與分析
2.1 最佳包被抗原濃度和一抗濃度確定
微間隙芯片和ELISA法的檢測步驟相似，本實驗采用ELISA法篩選包被液濃度和一抗濃度。鹽酸克倫特羅-BSA偶聯物包被液采用1000、100、10、1ng/mL這4個濃度梯度，一抗選取1︰40000和1︰80000兩個稀釋比例，以此檢測空白對照和100ng/mL鹽酸克倫特羅的吸光值，結果見表1，選取空白對照和樣品結果差值最大的包被液1000ng/mL和一抗稀釋度1︰40000用於微間隙芯片實驗。

2.2 檢測方法靈敏度
鹽酸克倫特羅的檢測靈敏度采用4個濃度的標準品進行檢測，微間隙陣列電極法的靈敏度檢測結果見圖1。由圖1可知，隨著鹽酸克倫特羅的濃度升高，電化學信號逐漸降低，檢測靈敏度可達到100pg/L。傳感器的電導率與鹽酸克倫特羅的濃度之間呈良好的線性關係，其線性方程為：電導率（pS）=-50.5904LogC+49.88，線性相關係數R2=0.9978。
2.3 檢測方法特異性分析
為驗證該方法的特異性，測定了鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林這4種瘦肉精，結果如圖2所示。從圖2可以看出，當加入鹽酸克倫特羅時芯片的電導率明顯降低，而加入其它瘦肉精或PBST時電導率明顯升高。本研究建立的方法對目標物鹽酸克倫特羅響應明顯，而對其它非目標物無響應，證明該方法特異性較高。 將建立的微間隙陣列電極檢測方法用於實際樣品中鹽酸克倫特羅的檢測，如表2。由表2可知，豬肉樣品中鹽酸克倫特羅的加標回收率在84.79%~89.74%之間。說明，本實驗所建立的檢測方法準確度較高，可用於實際樣品的測定。

3 結論
本文采用微間隙芯片免疫競爭法檢測小分子，待測樣品中鹽酸克倫特羅的濃度越高，其競爭性結合的單克隆抗體量也就越多，與包被的鹽酸克倫特羅-BSA結合到的抗體量越少，最終測定的電極間的電導率也就越小。因此，樣品中鹽酸克倫特羅含量與電導率呈反比。當鹽酸克倫特羅濃度在100μg/L~100pg/L範圍內時，鹽酸克倫特羅濃度的對數值與檢測電導率之間呈良好的線性關係，相關係數為0.9978，檢測靈敏度為100pg/L，陳曦等[6]報道的ELISA法靈敏度為5μg/L，國家標準檢測方法液相色譜串聯質譜法的檢測限為0.5μg/kg[7]。該方法用於豬肉的分析，加標樣品回收率均在80%以上；檢測限高於酶聯免疫法和儀器法，與萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林無交叉反應。此外，該芯片的規模化生產及高通量檢測儀器設備的研發有助於方法的推廣使用。
參考文獻：
[1] FREDY M T, SALVADOR V L, ARTURO E M. Application of high-performance liquid chromatography-UV detection to quantification of clenbuterol in bovine liver samples[J]. Journal of food and drug analysis, 2013,(21): 414-420.
[2] THEVIS M, SCHEBALKIN T, THOMAS A, et al. Quantification of clenbuterol in human plasma and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chromatographia, 2005,62: 435-439.
[3] GARCÍA I, SARABIA L, ORTIZ M C, et al. Three-way models and detection capability of a gas chromatography-mass spectrometry method for the determination of clenbuterol in several biological matrices: the 2002/657/EC European decision[J]. Analytica Chimica Acta, 2004, 515: 55-63.
[4] REN Xiang-fu, ZHANG Fu-mei, CHEN Fa-ju, et al. Development of a sensitive monoclonal antibody-based ELISA for the detection of clenbuterol in animal tissues[J]. Food and Agricultural Immunology, 2009, 20(4): 333-344.
[5] WU Can, SUN Dong, LI Qing. Electrochemical sensor for toxic ractopamine and clenbuterol based on the enhancement effect of graphene oxide[J].Sensors and Actuators B, 2012, (168):178-184.
[6] 陳曦，曹慧，徐斐，等.鹽酸克倫特羅酶標抗原的製備及其ELISA檢測[J].江蘇農業學報，2013，29(2):458-460.
[7] 中華人民共和國國家標準：《動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯質譜法》（GB/T 22286-2008）.

作者簡介：楊麗霞（通信作者），博士，高級工程師，從事世界杯賽程預測分子生物學研究。