采用快速顯色培養基檢測蠟樣芽孢杆菌更具優勢

□ 上海博爾卡國際貿易有限公司 供稿

生乳(原料乳)是乳製品的基礎原料，一般情況下，生乳中的微生物主要是一些無害的細菌，但在後續的成品生產過程仍需經殺菌處理。因此，《世界杯賽程預測國家標準 生乳》(GB 19301-2010)中並沒有規定生乳的致病菌檢測標準，僅要求菌落總數限量≤2×106cfu/mL(g)。

實際上，監控食品中微生物的種類有利於尋找汙染源頭，把控產品質量。在常見的微生物種類中，芽孢杆菌屬廣泛存在於牧場環境和動物飼料中，故在生乳中的檢出頻率較高。其中，部分致病菌會產生非常耐熱的毒素。以蠟樣芽孢杆菌為例，其芽孢需在100℃的高溫下持續20min以上才能被殺死。同時，蠟樣芽孢杆菌是條件致病菌，且產生腸毒素的條件較為苛刻，大多數情況下菌量保持在較高水平，即≥105CFU/mL(g)【《蠟樣芽胞杆菌食物中毒診斷標準及處理原則》(WS/T82-1996)】，少數情況下較低菌量也會引起食物中毒。由於生乳營養豐富，且在適宜溫度(28~35℃)下極易使蠟樣芽孢杆菌大量生長繁殖，因此，將該菌的檢測納入風險監控對保證乳品安全具有重要意義。

圖1 MYP 培養基上呈微粉紅色的典型菌落

目前，生乳中蠟樣芽孢杆菌的檢測主要有如下兩項難點。

1 MYP平板中的菌落容易蔓延

《世界杯賽程預測國家標準 食品微生物學檢驗 蠟樣芽胞杆菌檢驗》(GB 4789.14-2014)選用甘露醇卵黃多粘菌素(MYP)培養基，其中的典型菌落為微粉紅色(表示不發酵甘露醇)，周圍有白色至淡粉紅色沉澱環(表示產卵磷脂酶)，經過純化培養後再進行鏡檢和生化鑒定。

然而，由於MYP特異性較低，且在檢測諸如生乳這種微生物種類及含量均較多的樣品時，卵磷脂酶分解培養基中的卵黃會產生沉澱帶，容易使菌落之間漫延連接，導致部分非目標種類菌發酵甘露醇將整個平板“染成”黃色，進而難以鑒定和計數，致使不能準確出具檢測報告。

圖2 菌落漫延連接且部分種類非目標菌發酵甘露醇將整個平板“染成”黃色

2 蠟樣芽孢杆菌組(B.cereus group)中其它菌種的幹擾

蠟樣芽孢杆菌的生化特征與其同組(蠟樣芽孢杆菌組B.cereus group)的蘇雲金杆菌非常相似，參照GB 4789.14-2014中的生化鑒定要求，二者的區別僅僅是後者在芽孢形成時能產伴胞晶體，且該伴胞晶體大部分存在於細胞內，極少數部分遊離。因此，需要延長菌落在純化平板上的培養時間(3天以上)，並通過電子顯微鏡觀察有無伴胞晶體來區分二者;或將待測菌落細胞壁打破，在大量增加遊離的伴孢晶體數量的情況下使用相對應的特異性抗體類產品進行檢測。

圖3 蠟樣芽孢杆菌標準菌株加入生乳後在顯色平板上的生長情況

因為單個典型菌落難以分離，所以容易導致後續鑒定更加困難。博爾卡(Biokar)的COMPASS® BACILLUS CEREUS顯色培養基可以有效解決上述問題——其特殊的選擇性成分可以避免絕大多數汙染菌群的幹擾，顯色底物與COMPASS® BACILLUS CERE US瓊脂配方中選擇劑之間的相關性允許僅在孵育24小時後直接計數特征性菌落，且無需確認。目前，該方法已經獲得AFRNOR認證。圖3為蠟樣芽孢杆菌標準菌株(CMCC(B)63303)加入生乳後在顯色平板上的生長情況(與圖2為同一樣品)，蠟樣芽孢杆菌呈現典型的藍綠色，白色菌落為非蠟樣芽孢杆菌。此外，鏡檢時如觀察不到芽孢結構，繼續培養1~2天即可，如圖4。

圖4 鏡檢時的菌落

為確保COMPASS® BACILLUS CEREUS顯色培養基快速檢測方法的準確性，博爾卡使用41株不同的幹擾菌株及41株蠟樣芽孢杆菌組內菌株(不同種類或分型)進行了驗證，並取得了令人滿意的結果——在克服傳統方法部分劣勢的同時縮短了檢測時間，證明該方法對實驗室檢測工作效率的提升具有十分重要的意義。