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LC-MS/MS法同時快速檢測牛肉中12種β-受體激動劑的應用研究

2020-09-25 12:22:31 來源: 世界杯賽程預測 導刊

　　LC-MS/MS法同時快速檢測牛肉中12種β-受體激動劑的應用研究
　　β-受體激動劑，俗稱瘦肉精，不是某一種特定的藥物，而是一類藥物，能夠促進瘦肉生長、抑製肥肉生長。當它們以超過治療劑量5-10倍的用量用於家畜飼養時，即有顯著的營養“再分配效應”，促進動物體蛋白質沉積、促進脂肪分解抑製脂肪沉積，能顯著提高胴體的瘦肉率、增重和提高飼料轉化率，因此曾被用作牛、羊、禽、豬等畜禽的促生長劑、飼料添加劑。[1-3]
　　但瘦肉精用量大、作用的時間長、代謝慢，所以在屠宰前到上市，在動物體內的殘留量都很大。這個殘留量通過食物進入人體，就使人體漸漸地中毒，如果一次攝入量過大，就會出現異常的生理反應，因此而被禁用。人若食用含瘦肉精的肉類後會出現頭暈、惡心、手腳顫抖、心跳加速甚至心髒驟停致昏迷死亡，特別對心律失常、高血壓、青光眼、糖尿病和甲狀腺機能亢進等患者有極大危害。[4-7]
　　在中國，通常所說的“瘦肉精”則是指鹽酸克倫特羅。它曾經作為藥物用於治療支氣管哮喘，後由於其副作用太大而遭禁用。其它類似藥物還有沙丁胺醇和特布他林等，都因為對人體健康危害過大，造成安全隱患，而在全球遭到禁用。在2001年12月27日、2002年2月9日、4月9日，農業部分別下發文件禁止食品動物使用β-受體激動劑類藥物作為飼料添加劑（農業部176號、193號公告、1519號條例）[8-12]。
　　因為能夠促進瘦肉生長、抑製動物脂肪生長，瘦肉精讓豬、牛、羊等牲畜的瘦肉率提高，帶來更多經濟價值，國內養殖戶不顧農業部的規定，在飼料中摻入過量瘦肉精，給市場上的肉類食品帶來了嚴重的安全隱患，所以研究出科學、高效、快速、準確的檢測方法十分必要。
　　目前常用的β-受體激動劑檢測方法有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜質譜聯用法（GC/MS）、酶聯免疫法（ELISA）和液相色譜串聯質譜法（LC/MS/MS）。其中HPLC法靈敏度較低，不能滿足痕量檢測要求[13-15]；GC/MS法除了需要大量的前處理步驟，還要求進行衍生化操作，較為繁瑣；ELISA法雖然操作簡單，但極容易出現假陽性情況，定性結果的準確性較差；隻有LC/MS/MS法具有高效的分離能力和準確的定性定量能力，被廣泛使用，但此法也因為複雜耗時的前處理而被詬病[16]。因此建立一種科學、高效、快速、準確的檢測方法十分必要。
　　材料與方法
　　儀器與試劑
　　儀器名稱：NexeraX2超高效液相色譜和8045電噴霧三重四級杆質譜儀（日本島津）、ULPHW-I超純水機（上海優普）、MTN-2800W氮吹濃縮儀（德國AUTO Science公司）、超聲波清洗機（昆山潔力美）、H1850R冷凍離心機（湘儀儀器）、TG16-WS高速離心機（湘儀儀器）、VM-D渦旋混合器（上海皓莊儀器）、JY2002百分之一電子天平（舜守恒平儀器）、肉類絞碎機（嘉廚食品機械）、ATX224萬分之一電子天平（日本島津）；儀器經校準檢定合格後方可使用。
　　標準溶液名稱：實驗所用β-受體激動劑類標準品：鹽酸克倫特羅（Clenbuterol）、萊克多巴胺 ( Racto pamine）、沙丁胺醇（Salbutamol）、特布他林（Terbutaline）、西馬特羅(Cimaterol)、氯丙那林（Clorprenaline）、溴布特羅(Brombuterol)、齊帕特羅 (Zilpaterol)、噴布特羅（Penbutolol)、馬布特羅（Mabuterol)、妥布特羅（Tulobuterol)、非諾特羅（Fenoterol）采購於曼哈格公司。
　　同位素內標克倫特羅-D9 (Clenbuterol-D9）、萊克多巴胺-D3 (Ractopamine-D3）、沙丁胺醇-D3(Salbutero1-D3），購於Dr .Ehrenstorfer公司。
　　實驗試劑與耗材：乙腈（上海安譜公司，色譜純）、甲醇（上海安譜，色譜純）、乙酸（山東西亞，色譜純）、甲酸（山東西亞，色譜純）、無水硫酸鎂（國藥集團，分析純）、無水硫酸鈉（國藥集團，分析純）、乙酸銨（國藥集團，分析純）、乙二胺四乙酸二鈉（國藥集團，分析純）、C18填料(天津博納艾傑爾), 粒徑40-60μm、PSA填料(天津博納艾傑爾), 粒徑40-60μm、GCB填料(天津博納艾傑爾)，粒徑40-60μm；
　　方法
　　實驗色譜和質譜條件
　　色譜條件為：色譜柱： C18色譜柱， 規格2.1×100mm，粒徑1.9μm；柱溫：32℃；進樣體積：2μL；流速：0.3mL/min；流動相A是體積濃度為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸水溶液[17]，洗脫梯度，洗脫條件見表1；所述初始流動相是體積比為9:1的0.1%甲酸水溶液和乙腈的混合液；
　　質譜條件為：霧化氣流速：3.0L/min；幹燥氣流速：10.0L/min；加熱氣流速：10.0L/min；DL管溫度250℃[18]；加熱氣溫度：350℃；接口電壓：4000V；離子源類型：電噴正離子模式；掃描方式：多反應監測掃描；氦氣作為碰撞氣，霧化氣和加熱氣均為氮氣，幹燥氣為潔淨空氣，各個物質及內標物的主要質譜參數見表2:
　　標準溶液的製備
　　混合標準工作溶液：分別稱取10mg的鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林、西馬特羅、氯丙那林、溴布特羅、齊帕特羅、噴布特羅、馬布特羅、妥布特羅、非諾特羅12種β-受體激動劑，用甲醇溶解並定容至100mL,此貯備液濃度為100mg/L，得到混合標準貯備液，用0.1%甲酸水-乙腈（9:1）來稀釋混合標準貯備液，配製混合標準工作溶液，濃度梯度為0.1ng/mL，0.2ng/mL，0.5ng/mL，1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL，且每個濃度梯度中均加入有6ng的同位素內標物, 同位素內標物由質量比為1:1:1的克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D3和沙丁胺醇-D3組成。
　　混合內標標準工作溶液：分別稱取10mg的克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D3和沙丁胺醇-D3三種β-受體激動劑內標物質,用甲醇溶解並定容至100mL,此貯備液濃度為100mg/L，得到混合內標標準貯備液，用0.1%甲酸水溶液稀釋混合內標標準貯備液，配製混合內標標準工作溶液，使其濃度都相當於50ng/mL。
　　混合標準貯備液和混合內標標準貯備液需保存在-20℃冰箱中冷凍，有效期一年；混合標準工作溶液和混合內標標準工作溶液需保存在4℃冰箱中冷藏，有效期一周。
　　混合提取劑的製備
　　混合提取劑是體積比為2:1:9的0.25mol/L乙酸銨水溶液、0.1mol/L乙二胺四乙酸二鈉水溶液和1.5%甲酸乙腈溶液的混合液；所述0.25mol/L乙酸銨水溶液用乙酸調節pH值為5.2[19]。
　　混合除水試劑的製備
　　混合除水試劑由質量比為3:1的無水硫酸鎂和無水硫酸鈉組成。
　　混合淨化試劑的製備
　　混合淨化試劑由500mg無水硫酸鎂，75mg N-丙基乙二胺,100mg十八烷基鍵合矽膠,25mg石墨化碳黑組成[20]。
　　樣品溶液的製備
　　購買牛肉實驗樣品8份（每份不少於500g），對市麵上購買的實驗樣品（不少於500g）進行絞碎處理，並充分混勻樣品，稱取5.0g絞碎後的牛肉樣品，向豬肉樣品加入120μL混合內標標準工作溶液和12mL混合提取劑，旋渦混勻1min，超聲處理20min後，加入4.0g混合除水試劑，混勻，10000rpm離心3min，得到提取液；量取3mL提取液於離心管，加入混合淨化試劑，漩渦震蕩30s，5000rpm離心1min後，40℃水浴氮氣吹至近幹後，用1mL初始流動相定容，經0.22μm濾膜過濾，得到樣品溶液。
　　上機檢測
　　用液相色譜串聯質譜儀檢測樣品溶液和混合標準工作溶液，並以β-受體激動劑的質量濃度為橫坐標，以β-受體激動劑的峰麵積為縱坐標，進行線性回歸，計算牛肉中β-受體激動劑的含量。
　　結果分析
　　標準溶液曲線圖
　　12種混合合標準工作溶液的圖譜見圖1；
　　1沙丁胺醇、2特布他林、3西馬特羅、4萊克多巴胺、5鹽酸克倫特羅、6氯丙那林、7溴布特羅、8齊帕特羅、9噴布特羅、10馬布特羅、11妥布特羅、12非諾特羅
　　控製各個化合物質量濃度梯度為0.1ng/mL，0.2ng/mL，0.5ng/mL，1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL，以各個標準工作溶液的質量濃度X為橫坐標，以其標準品的峰麵積Y為縱坐標，繪製標準工作曲線。同時要控製待測樣品的質量濃度在標準工作曲線的範圍內。分析實驗數據後得到12種化合物的線性方程，相關係數，保留時間，和檢測低限見表3：
　　8份牛肉實驗樣品檢測結果見表4：
　　經實驗分析，在不同市場上購買的新鮮牛肉均未檢出此方法中講述的12種β-受體激動劑。
　　選取空白基質樣品，使用上述前處理方法，儀器分析方法以及耗材和儀器對其進行了添加回收實驗，添加量分別為0.5ng/mL，2.5ng/mL，7.5ng/mL，色譜圖峰型良好，保留時間較穩定，能夠滿足檢測需求，實驗結果見下表5：
　　表5可以看出，本方法的添加回收率為85.37%-97.78%，RSD≤11.6%，表明本方法可以保證檢測結果的準確度和可重複性，可達到檢測要求，滿足豬肉中β-受體激動劑的檢測。
　　結果與討論
　　本實驗建立一種同時快速檢測牛肉中12種β-受體激動劑的LC-MS/MS法。本方法中12種β-受體激動劑在質量濃度為0.1ng/mL~10.0ng/mL範圍內線性關係良好（R2≥99.85），添加回收率為85.37%-97.78%，RSD≤11.6%。本方法檢測準確度高、定性準確快捷、無需對樣品衍生化處理、前處理時間短、減少基質幹擾、檢測時間短、同時減少有毒試劑的使用，值得推廣使用。
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　　項目基金：基金項目：安徽省科技重大專項(農業領域)基金項目(18030701203)。
　　作者簡介：張洋，男，工程師，研究方向為 食品檢測。
　　張洋
　　安徽國科檢測科技有限公司，安徽合肥，230001

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