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一起疑似攝入飲食感染霍亂疫情病原體的實驗室快速檢測

2020-07-28 13:23:27 來源: 世界杯賽程預測 導刊

　　一起疑似攝入飲食感染霍亂疫情病原體的實驗室快速檢測
　　進一步提高實驗室技術水平，多種檢測方法並用，切實發揮實驗室檢測在疫情快速準確處置中的重要作用。方法 在應用傳統微生物學鑒定方法的同時，運用實時熒光PCR法和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀進行快速鑒定。結果 此次疑似霍亂疫情被排除，導致患者發病的致病性微生物最終鑒定為副溶血性弧菌，血清型為O3：K6型，毒力基因為tlh+、tdh+、trh-，藥物敏感實驗均為敏感。結論 實驗室多重檢測技術並用，快速準確高效地為流行病學調查和醫療機構治療提供了強有力的技術支撐。
　　關鍵詞：霍亂弧菌；多重檢測技術並用；快速準確鑒定；副溶血性弧菌
　　中圖分類號：R155.5+5
　　霍亂是由攝入的食物或水受到霍亂弧菌汙染而引起的一種急性腹瀉性傳染病，在《中華人民共和國傳染病防治法》規定中屬於甲類傳染病之一，可導致人類急性感染性腹瀉，主要由O1 群和O139群霍亂弧菌引起。病發高峰期主要發生在夏季，傳播途徑主要是糞—口傳播，人感染後嚴重者能在數小時內造成腹瀉脫水甚至死亡[1-3]。因此，對於霍亂的快速應對、精準處置、有效控製是控製疫情蔓延的必要手段。其中，實驗室對病原體的快速準確鑒定，是疫情處置的關鍵支撐。
　　疫情的發生及經過
　　2019年8月22日早8點，淄博市疾病預防控製中心接到所轄沂源縣疾病預防控製中心電話，沂源縣醫院8月21日晚接診一名水樣便腹瀉病人，經霍亂快診試劑檢測，報告O139群快診弱陽性。縣醫院立即報告縣疾控中心，縣疾控中心立即組織專業人員趕赴現場，進行調查處置，指導縣醫院按照腸道傳染病進行隔離治療並采集病人標本，帶回縣疾控進行檢驗。8月22日早7點，挑取可疑菌落進行快診檢驗，仍然顯示O1群弱陽性。隨即，沂源縣疾控中心立即報告淄博市疾控中心，並派專人專車將病人糞便及相應增菌液、分離平板上送市疾控中心進行複核檢驗。
　　實驗室檢測複核
　　實驗材料
　　3%NaCl堿性蛋白腖水（北京陸橋技術股份有限公司）、4 號瓊脂（北京陸橋技術股份有限公司）、弧菌顯色培養基（科瑪嘉）、TCBS瓊脂（北京陸橋技術股份有限公司）、霍亂弧菌ctxAB核酸熒光PCR法檢測試劑盒（深圳生科原）、副溶血性弧菌三重核酸熒光PCR法檢測試劑盒（深圳生科原）、副溶血性弧菌診斷血清（日本生科研）、革蘭氏陰性菌藥敏測試板（德國Thermo Fisher）、熒光定量PCR儀（ABI7500）、基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀（德國Bruker公司）。
　　標本種類及數量
　　複核標本3份（患者糞便堿性蛋白腖水增菌液1份、患者糞便分離弧菌顯色平板和4號瓊脂平板各1個），患者糞便1份。
　　檢測方法
　　霍亂弧菌參照衛生部《霍亂防治手冊》第六版(2013年)[4]進行；副溶血性弧菌參照GB4789.7-2013《世界杯賽程預測國家標準 食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》[5]。
　　增菌：取病人糞便接種於3%NaCl堿性蛋白腖水中於37℃增菌6～8h。
　　分離培養：取病人糞便和複核標本（糞便堿腖水增菌液）分別劃線接種於弧菌顯色平板、TCBS瓊脂平板和4號瓊脂平板，於37℃培養18～24h。上送的複核標本（患者糞便分離平板）繼續於37℃進行培養。
　　氧化酶試驗：挑取分離平板生長的菌落進行氧化酶試驗，在1～2min內試紙變為紫色判為氧化酶試驗陽性，不變色判為陰性。陽性的菌落劃線3%NaCl TSA平板進行純培養。
　　霍亂弧菌毒力基因檢測：取複核標本（糞便堿性蛋白腖水增菌液、糞便分離弧菌顯色平板和4號瓊脂平板上氧化酶陽性的可疑菌落）和患者糞便分別進行霍亂弧菌ctxAB毒力基因檢測，具體檢驗方法參照試劑盒說明書。結果判定以樣本檢測Ct值≤34.5為陽性、Ct值≥37.5或無Ct值為陰性、Ct值在34.5～37.5範圍則需對樣本進行重複檢測。結果說明見表1。
　　質譜儀鑒定：挑取上送的複核標本（患者糞便劃線分離的平板生長的菌落）進行質譜儀鑒定。
　　副溶血性弧菌血清學鑒定：參照GB4789.7-2013《世界杯賽程預測國家標準 食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》[5]。
　　副溶血性弧菌毒力基因檢測：在一個PCR反應體係中同時檢測副溶血性弧菌tlh、tdh、trh基因，具體檢驗方法參照試劑盒說明書。結果判定以樣本檢測Ct值≤36為陽性、Ct值≥39或無Ct值為陰性、Ct值在36～39範圍則需對樣本進行重複檢測。結果說明見表2。
　　副溶血性弧菌藥物敏感性實驗：采用微量肉湯稀釋法，按照美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）中推薦的弧菌藥敏實驗抗生素的選擇原則選取8種抗生素。
　　結果
　　複核標本初步快速鑒定：複核標本進行了相應的氧化酶實驗、霍亂弧菌ctxAB毒力基因檢測和質譜儀鑒定，鑒定結果見表3。
　　菌落鑒定：挑取疑似的副溶血性弧菌經3%NaCl TSA純化後的菌落，分別進行氧化酶實驗、質譜儀鑒定和毒力基因檢測，結果見表4。
　　血清學鑒定：對鑒定確認的副溶血性弧菌進行血清學分型，結果均為O3：K6型。
　　耐藥檢測：利用微量肉湯稀釋法，經商品化藥敏板鑒定，結果均為敏感。藥物名稱及濃度見表5。
　　討論
　　在此次疑似霍亂疫情中，為了快速確認是否是霍亂，我們首先將病人糞便和複核樣本（糞便初步增菌液、分離平板生長出的菌落）進行了霍亂弧菌毒力基因檢測，利用熒光PCR方法特異性強的優勢，來進行輔助判定。經過3個小時左右的實驗，熒光PCR結果顯示陰性。由於複核樣本培養時間短，生長出的菌落形態不十分典型，為了進一步確認到底是何種致病性微生物，我們分別挑取可疑菌落進行了飛行時間質譜儀鑒定，鑒定結果均為副溶血性弧菌。副溶血性弧菌耐熱性直接溶血素(tdh)或者耐熱性直接溶血素相關溶血素(trh)是導致副溶血性弧菌致病的主要毒力因子[6-7]，而且O3:K6血清型是引起副溶血性弧菌感染爆發的優勢血清型[8-9]。我們對鑒定的10株副溶血性弧菌進行純化，又分別進行了毒力基因檢測、血清學檢測和耐藥檢測，毒力基因結果為tlh陽性、tdh陽性、trh陰性，血清型為O3：K6型，耐藥檢測均為敏感，這也與陳玉貞在山東省副溶血性弧菌生物多態性和耐藥性研究[10]中相符。
　　在疫情的處置中，實驗室的快速準確檢測是重中之重。首先，在對患者糞便進行增菌的同時，可以直接劃線分離選擇性平板，以此來節省18～24h。其次，在細菌鑒定的傳統方法中，同時運用特異性強的實時熒光PCR分子生物學技術來輔助鑒定，為傳統的生化鑒定指明了方向。再次，在獲得純化後新鮮生長的可疑菌落後，利用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀對菌落進行鑒定，既省去了傳統生化鑒定的繁瑣步驟，又節約了24～48h的傳統生化鑒定時間，為疫情防控和流行病學調查搶得寶貴時間。在這次的疑似霍亂疫情處置中，檢驗人員爭分奪秒、思路明確、有條不紊，在最短的時間內上報實驗結果，成功地為身在一線的流調人員流行病學調查和醫療機構的準確用藥提供了可靠的技術支撐。
　　參考文獻：
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　　[5]中華人民共和國國家和衛生計劃生育委員會.GB4789.7 - 2013世界杯賽程預測 國家標準食品微生物學檢驗副溶血性弧菌檢驗[S]. 北京：中國標準出版社，2013．
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　　[9]鄭文龍[1], 王卓[1], 馬潔[1],等. 副溶血性弧菌病原學和分子流行病學流行特征研究進展[J]. 疾病監測, 2015, 30(4):337-341.
　　[10]陳玉貞.山東省副溶血性弧菌生物多態性和耐藥性研究[D].山東：山東大學, 2016.
　　基金項目：山東省醫藥衛生科技發展計劃項目（2017WS562）；課題名稱：副溶血性弧菌的致病性及分子生物學檢測研究；
　　作者：吳瑩，女，淄博市疾病預防控製中心衛生檢驗中心 主管技師，碩士，主要從事微生物檢驗研究。
　　吳瑩 王銀平 張群 王延東
　　淄博市疾病預防控製中心，山東 淄博 255026
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