基於多反應監測模式下的超高效液相色譜-串聯質譜法檢測動物源性

基於多反應監測模式下的超高效液相色譜-串聯質譜法檢測動物源性食品中19種氟喹諾酮類抗生素殘留

□ 王婷 錫林郭勒盟食品藥品檢驗檢測中心

□ 陳明濤 錫林郭勒食品藥品檢驗檢測和風險評估中心

摘　要：本文的目的是建立動物源性食品中19種氟喹諾酮類抗生素殘留量的檢測方法，樣品經EDTA-Mcllvaine緩衝液提取、PEP固相萃取柱淨化，通過Thermo Fisher Hypersil Gold C18(內徑100×2.1mm，粒徑1.7μm)進行分離，再用0.2%甲酸水溶液和甲醇乙腈溶液(體積比為40∶60)洗脫體係分離目標化合物，將目標化合物的保留時間、前體離子、子離子碎片及其相對豐度作為定性依據，選擇響應穩定性好、信號強的子離子碎片作為定量離子，基質外標法定量。結果表明，19種氟喹諾酮類藥物在2~100ng/mL範圍內線性關係良好，相關係數均大於0.995;加標回收率在60%~120%，相對標準偏差均<20%。因此判定，該方法操作簡單、靈敏度高、重現性好，符合動物源性食品中多種氟喹諾酮類殘留量的檢測要求。

關鍵詞：多反應監測 氟喹諾酮 動物源性食品 超高效液相色譜-串聯質譜聯用

氟喹諾酮類抗生素藥物的發展曆史可以追溯到50多年前[1]。氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones，FQs)是人工合成抗菌藥[2-4]，又稱吡啶酸類、沙星類藥物，是喹諾酮藥物的第三代發展產物，主要包括恩諾沙星(Enrofloxacin)、諾氟沙星(Norfloxacin)、培氟沙星(Pefloxacin)、環丙沙星(Ciprofloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、沙拉沙星(Sarafloxacin)、依諾沙星(Enoxacin)、洛美沙星(Lomefloxacin)、吡呱酸(Pipemidic acid)、萘啶酸(Nalidixic acid)、奧索利酸(Oxolinic acid)、氟甲喹(Flumequine)、西諾沙星(Cinoxacin)、單諾沙星(Danofloxacin，又名丹諾沙星、達氟沙星)、馬波沙星(Marbofloxacin)、氟羅沙星(Fleroxacin)、奧比沙星(Orbifloxacin)、司帕沙星(Sparfloxacin)、雙氟沙星(Difloxacin)等。氟喹諾酮類藥物具有抗菌、抗支原體、抗球蟲等作用，可有效預防和治療動物泌尿生殖係統疾病、胃腸疾病，以及呼吸道、皮膚組織的感染性疾病，價格低、療效好[2]。但是，此類藥物在被廣泛用於畜牧業養殖、加工貯存的過程中必然會造成動物源性食品中(如肉製品、牛奶、雞蛋等)該類抗生素藥物的殘留[5-10]，人們長期食用此類食品可能導致身體出現細菌耐藥性、過敏、中毒、致癌、致畸、致突變等嚴重傷害[11-14]。

近年來，由於部分養殖戶和經營者為了躲避食品抽查而不斷變換或更新氟喹諾酮類抗生素的使用品種，致使動物源性食品中該類抗生素殘留超標問題時有發生，針對這一現象，擴大此類抗生素檢測範圍的探索應與時俱進。本文旨在建立超高效液相色譜-質譜聯用法以同時檢驗出動物源性食品中19種氟喹諾酮類抗生素的殘留量，優化檢驗方法、提高檢驗效率、擴大檢驗範圍，以期為在動物源性食品中開展多種抗生素殘留的檢測提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：Thermo TSQ QUANTUM ULTRA超高效液相色譜-三重四極杆質譜聯用儀(美國Thermo Fisher科技公司)、台式高效冷凍離心機(鹽城市安信實驗設備有限公司)、多管渦旋混合均質器(美國Thermo Fisher科技公司)、真空過柱裝置(天津市津騰實驗設備有限公司)、氮吹儀(天津恒奧科技發展有限公司)、百分之一電子天平(奧豪斯)、PEP固相萃取柱(200mg、6mL，博納艾傑爾)。

試劑：Quinolone Mix19(100μg/mL)：Enrofloxacin、Norfloxacin、Pefloxacin、Ciprofloxacin、Ofloxacin、Sarafloxacin、Enoxacin、Lomefloxacin、Pipemidic acid、Nalidixic acid、Oxolinic acid、Flumequine、Cinoxacin、Danofloxacin、Marbofloxacin、Fleroxacin、Orbifloxacin、Sparfloxacin、Difloxacin，均購自BEIJING MANHAGE BIO-TECH(編號C0006319);供試試劑有乙腈、甲醇、甲酸，均為HPLC級;氫氧化鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、磷酸氫二鈉均為優級純;實驗用水為屈臣氏蒸餾水。

樣品：市售豬肉20份、羊肉20份、雞肉10份、雞蛋10份、牛奶10份。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取

稱取試樣5.00g(精確到0.01g)置於50mL聚丙烯離心管中，加入15mL 0.1mol/L EDTA-Mcllvaine緩衝液，2500r/min渦旋混合1min，低溫(溫度低於20℃)超聲提取10min，10000r/min離心10min(溫度低於5℃)，取上清液。提取3次，合並上清液，EDTA-Mcllvaine緩衝液定容至50mL。

1.2.2 淨化

PEP固相萃取柱，使用前用6mL甲醇、6mL水進行活化。將10mL提取溶液以2~3mL/min的速度過柱，用2mL 5%甲醇淋洗，棄去淋洗液;小柱真空負壓抽幹(時間大於20min)，再用6mL甲醇洗脫並收集洗脫液;洗脫液於40℃下使用氮氣吹至近幹，用1mL 0.2%甲酸水溶液溶解，旋渦混合1min，過0.22μm濾膜，上機待測。

1.3 基質標曲製備

1.3.1 混合標準儲備液(10μg/mL)

精密吸取19種混合標準物質各1.00mL置於10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻備用。

1.3.2 混合標準中間溶液(1μg/mL)

精密吸取混合標準儲備液1mL置於10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻備用。

1.3.3 混合標準工作溶液(100ng/mL)

精密吸取混合標準中間溶液1mL，置於10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻備用。

1.3.4 基質標準工作曲線

分別使用不含氟喹諾酮類藥物的豬肉、羊肉、雞肉、雞蛋、牛奶作為空白基質。準確稱取陰性試樣5.00g(精確至0.01g)置於50mL聚丙烯塑料離心管中，分別加入不同體積的19種氟喹諾酮類混合標準工作溶液，然後加入EDTA-Mcllvaine緩衝溶液，在渦旋混合器上混合均勻，同樣品前處理及淨化步驟，待吹至近幹後，用初始比例流動相溶液定容配製成濃度分別為2、5、10、20、100ng/mL的標準係列。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Fisher Hypersil Gold C18(內徑100×2.1mm、粒徑1.7um);柱溫：40℃;進樣體積5μL;流速0.2mL/min;流動相A：0.2%甲酸水溶液，流動相B：甲醇-乙腈溶液(體積比為40∶60)。梯度洗脫條件見表1。

1.4.2 質譜條件

ESI正離子模式，噴霧電壓3.5kV，蒸發溫度350℃，離子傳輸管溫度350℃，鞘氣(N2)流量30arb，輔助氣(N2)10arb。

2 結果分析

2.1 方法優化

2.1.1 樣品製備

分別采用EDTA-Mcllvaine緩衝溶液和1%甲酸乙腈來提取豬肉、羊肉、牛奶中的19種氟喹諾酮類化合物，發現其雖然沉澱蛋白效果較好，但會因提取到更多的磷脂而嚴重幹擾出峰時間較晚的Cinoxacin、Oxolinic acid、Nalidixic acid和Flumequine，且加標回收率偏低。

采用EDTA-Mcllvaine緩衝溶液提取的樣品提取液在過PEP固相萃取柱時均出現了不同程度的堵塞情況，故實驗對比了過濾樣品提取液、分取樣品提取液和鎢酸鈉-硫酸沉澱樣品提取液3種方法解決淨化柱堵塞問題。結果表明，分取樣品提取液過PEP固相萃取柱實驗效率高，處理的樣品幹淨，回收率高。

圖1 羊肉中環丙沙星幹擾峰的分離情況

2.1.2 色譜質譜條件

考察了有機相為100%乙腈、100%甲醇、40%甲醇+60%乙腈的出峰分離情況。結果顯示，40%甲醇+60%乙腈在不同基質下分離度最好，目標化合物的保留時間在各種類型的基質中相對穩定，同時可將羊肉中的環丙沙星幹擾物徹底分離。

考察了水相為純水、0.2%甲酸水和5mmol甲酸銨水溶液的出峰分離情況，在水相中添加甲酸可提高儀器對目標化合物的響應且能夠改善峰形，而甲酸銨會導致背景升高，影響方法靈敏度，故選擇0.2%甲酸水。

將配製好的19種氟喹諾酮類化合物的混合標準中間溶液(1μg/mL)通過蠕動泵以5μL/min的流速注入質譜儀，調整離子源參數，待噴霧穩定後進行Q1四極杆全掃描，找到目標化合物的前體離子，設定碰撞能5~50eV區間分9次進行碰撞，通過Q3四極杆找到儀器響應和穩定性俱佳的定性離子和定量離子，同時進一步優化錐孔電壓，從而建立多反應監測模式分析方法。19種化合物質譜參數優化結果見表2。

2.2 方法參數驗證

2.2.1 線性實驗

以牛奶為例，用空白基質提取液將混合標準工作溶液分別稀釋濃度至2、5、10、20、100ng/mL，以氟喹諾酮質量濃度作為橫坐標(X)，定量離子的峰麵積作為縱坐標(Y)，進行線性擬合，得到基質匹配的標準曲線及相關係數，見表3。

圖2 20ng/mL牛奶基質中19種氟喹諾酮類化合物的總離子流圖

2.2.2 方法的靈敏度

以取樣量5.00g，在上述樣品處理與色譜質譜條件下，根據3倍信噪比和10倍信噪比所對應的各氟喹諾酮藥物質量濃度為儀器的檢出限和定量限。方法中19種氟喹諾酮的檢出限為0.03~0.5μg/kg，定量限為0.1~2μg/kg。

2.2.3 方法的精密度和回收試驗

在牛奶、豬肉、雞蛋陰性樣品中分別添加0.1、20和100μg/kg這3個水平進行添加回收實驗。按照上述方法進行測定，每個添加濃度測定6次，在較低濃度下，樣品添加回收率在60%~120%，相對標準偏差<20%，方法精密度良好。

2.3 樣品測定

采用上述檢測方法，對市售豬肉、羊肉、牛奶等70份樣品中19種氟喹諾酮類藥物殘留進行檢測，檢出氧氟沙星陽性樣品1份，樣品為羊肉，含量為15.8μg/kg。

3 結論與討論

本實驗運用超高效液相色譜-串聯三重四極質譜聯用儀建立的多反應監測模式下同時測定動物源性食品中19種氟喹諾酮類藥物殘留量，其靈敏度與回收率高，重現性好，抗幹擾能力強，符合我國對喹諾酮類藥物殘留的監管要求，能夠為世界杯賽程預測風險監測工作提供準確有效的理論依據。

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