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黃曲黴毒素檢測在線固相萃取柱的研究

2019-11-26 13:14:22 來源: 世界杯賽程預測 導刊

黃曲黴毒素檢測在線固相萃取柱的研究
　　摘要：黃曲黴毒素具有極強的致癌致畸性，其存在會嚴重危害人體健康，免疫親和柱方法存在價格昂貴、儲存條件苛刻、穩定性較差、保存期短等缺點，開發穩定性好、價格合理、萃取效率高的固相萃取柱，對於黃曲黴毒素的分析具有重要的意義。比較了不同固相萃取柱對黃曲黴毒素的分離效果，將在線固相萃取富集柱與分析柱串聯，目標化合物由萃取富集柱洗脫至分析柱，實現了萃取富集自動化，實現固相萃取柱的反複使用。
　　關鍵詞：黃曲黴毒素；免疫親和柱；固相萃取柱；雙三元液相色譜
　　黃曲黴毒素(Aflatoxin，AFT)是由黃曲黴和寄生曲黴等產生的一類結構相似的有毒化合物，基本結構為二呋喃環和香豆素。目前已分離鑒定的黃曲黴毒素達20多種，主要是黃曲黴毒素B1、B2、G1、G2、M1和M2[1]，因其具有致癌、致畸、致突變的危害，在1993年被世界衛生組織的癌症研究機構劃定為I類致癌物[2]。AFB1和AFM1是最受關注的兩個指標，化學結構如圖1所示。
　　圖1 AFB1(A)、AFM1 (B)的化學結構式
　　隨著多起黃曲黴毒素汙染事件的發生，世界各國相關機構和廣大消費者對世界杯賽程預測愈發關切。歐盟規定穀物中B1限量2.0μg/kg--8.0μg/kg，黃曲黴毒素總量4.0μg/kg-15.0μg/kg[3] 。我國規定乳及乳製品中M1含量不能超過0.5μg/kg，嬰幼兒配方及輔助食品中B1含量不能超過0.5μg/kg [4]。
　　常見的黃曲黴毒素分析中的前處理方法有液-液萃取法、固相萃取法、凝膠滲透色譜及免疫親和柱淨化法。樣品中黃曲黴毒素的提取主要是利用各種溶劑對樣品中的目標物質進行萃取。常用的前處理淨化方法包括: 超臨界流體萃取法、加壓流體萃取法、固相萃取法、免疫親和層析和分析印跡技術等。
　　國內最常用的檢測方法為免疫親和層析淨化高效液相色譜法，免疫親和柱價格昂貴、儲存條件苛刻、穩定性較差、保存期短等，使成本增加，因此開發穩定性好、價格合理、萃取效率高的固相萃取方法對於黃曲黴毒素的分析具有重要的意義。
　　固相萃取(solid phase extraction，SPE)是一項由液固萃取和色譜分離相結合的樣品前處理技術。主要用於樣品的分離、淨化和富集，達到降低樣品基質幹擾，提高檢測靈敏度的目的[5-7]。黃曲黴毒素檢測前處理過程複雜繁瑣和困難，對檢驗人員的操作技術要求高，需大量使用有機溶劑，且有檢測結果再現性不好、出現假陽性結果等問題。為此希望通過試驗證明該方法可實現與免疫親和柱法相當的高精度、高回收率結果，找到新的可替代方法，從而使檢驗成本大大降低。
　　材料和方法
　　材料與試劑。黃曲黴毒素B 1標準品(純度99%) Romer公司；乙腈(色譜純)國藥集團化學試劑有限公司；超純水(電阻率為18.2MΩ·cm，25℃) 美國Millipore公司；固相萃取柱填料H、 D、 L、M分別購買不同國內廠家。
　　儀器和設備。雙三元液相高效液相色譜儀(配有DFD熒光檢測器、六通閥) 賽默飛公司；510蠕動泵、7725i手動進樣器、200μL定量環美國Waters公司；Milli-Q純水器美國Millipore公司。
　　色譜條件。色譜柱：C 18 Kromasil柱(4.6mm×150mm，5μm)；固相萃取富集柱：L填料柱(20mm×21μm，5μm)；柱溫30℃；在線富集流動相：甲醇-水(40:60，V/V)，分析測定流動相：甲醇-水(40:60，V/V)。
　　結果與分析
　　SPE柱填料的優化。比較了不同填料的在線固相萃取柱的加標回收率，SPE柱填料類型分別為聚矽膠（H）、季銨鹽（D）、白炭黑（L）、中性氧化鋁（M）。回收率如圖2所示。
　　柱加標回收率分別為48.20%、38.2%、85.0%、54.0%，可以看出L填料效果更好，且色譜峰分離度好、信噪比高、對稱性好，優先選擇L填料。
　　在線SPE萃取方法研究。在線處理過程包括三個過程：
　　1.樣品組分由進樣器與左泵流動相引入到富集上進行富集(或純化)，幹擾物(或基質)則從柱上流出並排至廢液收集器，分析柱處於清洗與平衡的過程。
　　2.目標組分由富集(或純化)柱上轉移至分析柱的過程。
　　3.目標組分在分析柱上進行在線分離與定性（或定量）分析，富集（或純化）柱則進行離線清洗和平衡的過程，如圖3所示。
　　展望
　　采用在線固相萃取液相色譜-熒光檢測法準確地測定了黃曲黴毒素含量，幾分鍾即可完成一次實際樣品測定。樣品無須經過繁瑣的前處理過程，過濾後即可進樣，樣品的萃取和濃縮完全由液相色譜係統自動完成。與傳統的離線固相萃取相比，在線固相萃取技術不僅具有樣品需求量小，試劑消耗量少，還具有操作簡單，樣品分析成本低廉，回收率高等特點。
　　A 雙三元泵 B 自動進樣器 C 在線SPE柱
　　D 分析柱 E 檢測器 F 柱切換閥
　　參考文獻：
　　[1]吳丹.黃曲黴毒素在糧食和食品中的危害及防治[J].糧食加工,2007,(03): 91-94.
　　[2]Egner PA, Wang JB, Zhu YR, et al. Chlorophyllin intervention reducesaflatoxin-DNA adducts in individuals at high risk for liver cance r[J]. Proc Natl Acad Sci (USA), 2001, 98(25): 14601-10606.
　　[3]Commission Regulation(EC)No.1881/2006,Setting Maximum Levels for Certain Contaminants in foodstuffs.Official Journal of the European Union 2006,49,L364,5-24.
　　[4]GB 2761-2011世界杯賽程預測國家標準食品中真菌毒素限量[S].
　　[5]Camel V. Solid phase extraction of trace elements [J]. Spectrochim Acta Pt B-At Spec, 2003, 58(7):1177-1233.
　　[6]Polyamines by reversed-phase liquid-chromatography-improved separation systems for polyamines in cerebrospinal-fluid, urine and tissue [J]. J Chromatogr, 1986, 380(1): 19-32.
　　[7]Poole CF. New trends in solid-phase extraction [J]. Trac-Trend Anal Chem,2003, 22(6): 362-373.
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