常見真菌毒素的解讀及其檢測方案

□ 維德維康 供稿

真菌毒素在自然界中廣泛存在，有數據統計，全世界每年約有25%的食物受到不同程度的真菌毒素汙染，每年由於黴變汙染導致真菌毒素引起的農產品和工業原料的損失達數百億美元。由此可見，真菌毒素會對穀物類食品的生產者和消費者造成巨大損害。我國穀物黴變主要發生在長江以南地區，每年約使糧食減產3%~7%。據調查，除糧食、飼料外，在油料作物、種子、水果、幹果、蔬菜、調味品、煙草、麻類、乳和乳製品、發酵產品中都發現了不同程度的真菌毒素，其引起的疾病及傷害可以說給人們帶來了巨大的人員傷亡和財產損失。

1 什麼是真菌毒素

真菌毒素是真菌在適宜溫度、濕度條件下產生的次級代謝產物，在糧食和飼料衛生安全領域又俗稱為黴菌毒素。真菌為喜好氧氣的微生物，在厭氧條件下幾乎不能生存，因此穀物貯存時使用抽真空或充氮氣等方法都能有效避免真菌毒素的滋生。目前，己經分離和鑒定出400多種真菌毒素，而在糧食行業中最常見的真菌毒素主要有4種，即黃曲黴毒素、玉米赤黴烯酮、嘔吐毒素和赫曲黴毒素A。

2 來源及特點

2.1 真菌毒素的來源

真菌毒素的來源大體可分為兩個部分，即收獲前真菌毒素的來源與收獲後真菌毒素的來源。

2.1.1 收獲前真菌毒素的來源

任何生長中的農作物，包括飼草和穀物等，都容易在受到真菌汙染時產生真菌毒素。真菌在隨農作物由田間向飼料加工廠再向飼料槽的轉換過程中可能不會存活，即使有些真菌毒素被完整地保留下來，但飼料原料看上去顏色及外觀都不錯，常見指標檢測分析結果也不錯，而往往就是這些“不錯”的原料可能早就已經成為真菌毒素的避風港。

2.1.2 收獲後真菌毒素的來源

收獲後的農作物如果其貯存、運輸、加工、保藏的外部環境滿足真菌的生長條件，則真菌會繼續生長產毒。糧食飼料在收獲時未被充分幹燥或貯運過程中溫/濕度過高，糧食飼料上汙染的真菌就會迅速生長，此時真菌毒素會一直積累疊加，最終危害動物機體而不自知。

2.2 真菌毒素的特點

2.2.1 高效性

較低毒素濃度(μg/kg)的真菌毒素即能產生明顯毒性。在汙染比較嚴重的幾種真菌毒素中，黃曲黴毒素B1(AFB1)具有強毒性——是氰化鉀的10倍、砒霜的68倍，被世界衛生組織的腫瘤研究機構列為Ⅰ類致癌物質。然而，AFB1的存在極為普遍——在農作物和飼料中廣泛存在，其主要損害肝髒功能並具有強烈的致癌、致畸、致突變作用，能引起肝癌，甚至誘發骨癌、腎癌、直腸癌、乳腺癌、卵巢癌等。

2.2.2 高穩定性

低分子化合物非常穩定，可耐高溫。黃曲黴素具有較為穩定的化學性質，對熱不敏感——即便在100℃下暴露20小時也不能將其完全去除，隻有在280℃以上的高溫下才能被破壞。

2.2.3 富集性

真菌毒素所具有的抗化學生物製劑及物理滅活作用可以幫助其在生物鏈中不斷傳播、富集——原本殘留在土壤中的真菌毒素會被後來種植的穀物吸收，從而引起更多真菌毒素汙染及感染的問題。

2.2.4 特異性

分子結構不同，毒性相差較大。如黃曲黴毒素族有黃曲黴毒素B1、B2、M1、M2，各毒素的毒性均不同。

2.2.5 相加性

兩種以上的真菌毒素混合在一起造成的傷害遠超單一毒素產生毒害作用的總和。由於農作物可能被幾種真菌共同汙染，因此飼料中可能同時存在多種真菌毒素。

2.2.6 汙染地域性

動物飼料及農產品中真菌毒素的產生具有一定的地域性。例如，熱帶和亞熱帶區域是曲黴菌生長的最佳環境。盡管如此，飼料和農產品貿易的全球化導致真菌毒素在全世界範圍內傳播。

2.2.7 隱蔽性

真菌毒素檢測時常受到小分子物質(如糖苷、葡糖苷酸、脂肪酸酯和蛋白質)的掩蓋，這些小分子物質與真菌毒素結合在一起，導致檢測值顯示為錯誤的陰性結果。最終，這些被掩蓋的真菌毒素不能被傳統的分析方法檢測出來。但這些結合到真菌毒素上的分子可能在消化過程中被解除，從而釋放出真菌毒素，危害動物及人體健康。

3 四種常見的真菌毒素

3.1 黃曲黴毒素

黃曲黴毒素是一類由黃曲黴和寄生曲黴產生的次級代謝產物，性質較為穩定，溶點為268~269℃，高溫下可穩定存在，常規加熱和巴氏殺菌均不能將其有效去除。已知的黃曲黴毒素有20多種，包括直接由真菌代謝產生的AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，以及集體攝入黃曲黴毒素後所代謝產生的AFM1和AFM2。其中，以AFB1最為常見且毒性最強——是迄今為止已知毒性最強的物質之一。

黃曲黴毒素B1具有強致癌和致突變性，動物體肝髒為其主要損傷器官，可引發肝炎、肝壞死、肝硬化等疾病，最終造成肝衰竭甚至死亡，現已被國際癌症研究機構列為I類致癌物。黃曲黴毒素B1的汙染範圍較廣，玉米、小麥、大豆、大米、花生、飼料及乳製品等農產品均可檢出，其中，玉米、小麥、大豆和飼料受黃曲黴毒素B1的汙染情況較為嚴重。在高溫、高濕的熱帶和亞熱帶地區，農產品和食品中黃曲黴毒素具有較高的檢出率;國外發達國家包括歐洲地區、北美、日本等地，食品、飼料、奶製品中的AFB1超標率較低;中東及非洲等發展中國家的AFB1汙染率較高。國外，黃曲黴毒素超標較為嚴重的食品為玉米，其黃曲黴毒素含量高時可達4.8mg/kg，超過限量200多倍。國外AFM1的汙染情況與AFB1類似，發達國家或地區超標率非常低，而中東及非洲等發展中國家的AFM1超標率則相對較多;且國外有大量關於母乳中AFM1含量的報告。

在我國，花生及製品、食用油、餅粕及飼料和玉米、大米等農產品中黃曲黴毒素汙染比較嚴重，且歐盟的限量標準遠低於我國標準，故已引發多起因黃曲黴毒素超標而導致的農產品國際貿易糾紛。如2000年我國出口到歐盟的花生約40%存在黃曲黴毒素超標情況，因而遭到退貨或被迫轉口貿易，致使我國農產品進出口貿易受到巨大損失，不僅使我國對歐盟的花生出口貿易嚴重受限，而且極大影響了其他地區消費者對我國花生質量安全的信任，直接影響我國花生出口貿易的競爭力。

3.2 嘔吐毒素

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，主要由禾穀鐮刀菌、黃色鐮刀菌和燕麥鐮刀菌產生，是單端孢黴烯B族毒素。

1973年，Vesohder從引起母豬拒食和嘔吐的玉米中分離得到該毒素，並根據它能引發動物嘔吐的特征將其定名為嘔吐毒素(Vomitoxin，VT)。DON是雪腐鐮刀菌稀醇的脫氧衍生物，也是一種全球性的穀物汙染物。

DON的主要產生菌是禾穀鐮刀菌，其為小麥赤黴病與玉米穗腐病的重要病原菌，大多於低溫、潮濕和收割季節，在穀物莊稼中慢慢生長。DON一般在大麥、小麥、玉米、燕麥中含有較高的濃度，而在黑麥、高梁、大米中的濃度較低。DON對糧穀類的汙染狀況與產毒菌株、溫度、濕度、通風、日照等因素有關。其熱反應較為穩定，一般的烹調及加熱不能破壞其毒性，但它對堿性環境比較敏感，用碳酸鈉溶液洗滌糧食可除掉70%左右的DON。

由於糧食中往往存在多種真菌毒素，因此會出現毒素間的協同作用、相加作用等不同情況。DON與玉米赤黴烯酮存在協同作用，能夠引起潛在的繁殖功能障礙。雪腐鐮刀菌烯醇和DON存在相加作用，同時攝入這兩種毒素的動物會出現較重的臨床症狀。

3.3 玉米赤黴烯酮

玉米赤黴烯酮(ZEN)是由多種鐮刀菌(主要由禾穀鐮刀產生)在代謝過程中產生的一種非類固醇結構產物。此外，玉米赤黴烯酮在許多高等植物體內存在，並作為植物體內的一種激素來調控植物的生長，例如小麥、大豆、棉花等在開花時玉米赤黴烯酮也達到峰值。

玉米赤黴烯酮可被胃腸道持續吸收，肝腸循環可使其在胃腸道滯留時間延長，其主要隨糞便排出，少量可由乳汁排泄。ZEN在動物體內與葡萄糖醛酸結合後還原為玉米赤黴烯醇，該毒素主要汙染物為穀物及其製品，可發生於農作物的生長、收獲、貯存和加工等各環節。濕度較高的環境條件下鐮刀菌更易生長繁殖，因此雨量充沛、相對濕度較高的地區，玉米赤黴烯酮汙染情況較為嚴重。

玉米赤黴烯酮為雌激素類似物，急性毒性較低，主要作用於生殖係統，故具有生殖毒性，可造成生殖激素係統紊亂，嚴重影響動物機體的繁殖機能。

3.4 赭曲黴毒素A

赭曲黴毒素是由曲黴屬和青黴屬的某些黴菌結合產生的真菌毒素，主要有7種結構類似物，分別是赭曲黴毒素A、赭曲黴毒素B、赭曲黴毒素C、赭曲黴毒素D、甲酯化的赭曲黴毒素A及甲酯化或乙酯化的赭曲黴毒素B。從對穀物的汙染率、汙染水平及對人畜的毒性考慮，赭曲黴毒素A是其中最重要的且具有衛生學意義的黴菌代謝產物。

赭曲黴素的汙染範圍較廣，幾乎可汙染玉米、小麥在內的所有穀物。正常條件下，小麥和玉米受汙染的機率較小，約1%~5%，其含量為0.01~5mg/kg;大麥和燕麥被汙染的機率較高，約為10%，其含量一般在0.1mg/kg以下。

4 維德維康真菌毒素檢測方案-真菌毒素檢測係統

北京維德維康生物技術有限公司(以下簡稱“維德維康”)是一家專注於食品中有害化合物殘留快速檢測技術、動物疫病快速診斷技術研究及相關產品開發的中關村高新技術企業、國家高新技術企業、國家火炬計劃重點高新技術企業和北京市專利示範單位。多年來，維德維康深諳市場規律與用戶切身需求，致力於為食品生產、加工、流通領域的企業及政府監管部門提供先進的檢測技術、產品及綜合解決方案。

目前，維德維康擁有係統性的真菌毒素檢測手段，能夠為用戶提供完善的真菌毒素解決方案和服務，現有檢測產品包括：真菌毒素膠體金定性或半定量檢測卡、酶聯免疫吸附(Elisa)試劑盒和熒光定量快速檢測卡，以及高效液相色普(HPLC)與液相色譜-串聯質譜儀器確證平台。上述3種免疫學快速檢測方法的優勢在於：均可使用70%甲醇水統一提取糧食中常檢的4項毒素(嘔吐毒素、玉米赤黴烯酮、黃曲黴毒素B1和赭曲黴毒素A)，單次提取可同時檢測多種真菌毒素，較大程度的減少了前處理的工作量，提高了檢測效率。世界杯賽程預測國家標準GB 2761-2017所規定的上述4項真菌毒素限量標準分別為：嘔吐毒素≤1000ppb;玉米赤黴烯酮≤60ppb;黃曲黴毒素B1≤5~20ppb;赭曲黴毒素A≤5ppb。

4.1 膠體金檢測試紙條

膠體金檢測試紙條具備操作簡單、檢測時間短、不需要儀器設備進行結果讀取的優點;但其隻能進行定性或半定量檢測，靈敏度相對較低，且結果判定易受主觀因素影響。膠體金檢測卡適用於大批量樣本的初次篩選，後續可使用ELISA或儀器方法進行驗證。

4.2 酶聯免疫吸附檢測試劑盒

酶聯免疫吸附檢測試劑盒的操作相對複雜， 檢測結果易受人為操作影響，且檢測時間長(>30min)，不適用於少量樣本的檢測(成本高、耗時長)。但該產品靈敏度相對較高，可借助於酶標儀讀取並計算得到定量的檢測數據，適用於大批量樣本的同時檢測。

4.3 真菌毒素熒光定量快速檢測係統

根據糧食安全監測工作的實際需要，按照簡單、快速、準確、便攜和經濟等原則，維德維康熒光定量快速檢測係統集中整合了熒光定量快速檢測卡、必要的前處理設備、熒光免疫定量分析儀和雲端數據監管平台，將糧食真菌毒素的檢測統一於相同的前處理操作，並與搭建的雲端監管平台結合鏈接，實現了“樣品采集-樣本處理-真菌毒素提取-定量檢測-數據實時上傳”，且該過程可以進行全程監管。

4.3.1 真菌毒素熒光定量快速檢測箱

真菌毒素熒光定量快速檢測箱包含多種日常使用的儀器：熒光免疫定量分析儀FQ-S2、檢測卡孵育器、掌上離心機、粉碎機(毛刷)、旋渦振蕩儀、天平(千分之一)、20~200μL微量移液器、100~1000μL微量移液器、1~5mL微量移液器、稱量勺/稱量紙、100mL量筒、計時器、10mL/50mL離心管、1.5mL離心管、1.5mL&10mL&50 mL管架、200μL槍頭/盒、1mL槍頭/盒、儀器使用說明書。

4.3.2 熒光定量快速檢測卡

熒光定量檢測卡同時兼具了膠體金檢測卡操作簡便、檢測時間短(8min)，以及Elisa試劑盒靈敏度高、可定量的優點，還可借助於熒光免疫定量分析儀將檢測結果直接實時傳輸至雲端數據監管平台。

檢測原理為，將處理好的樣品滴加至加樣孔後，樣品中的目標物與釋放墊中的熒光微球標記抗體結合並向前層析，當達到檢測區域後，檢測線(T線)上固定的抗原與剩餘的部分熒光微球標記抗體結合，T線上結合的熒光微球標記抗體量與樣品中目標物的濃度成反比，C線上結合的熒光標記物樣品中待測物的含量無關。8min層析結束後，使用熒光免疫定量分析儀讀取T線和C線的熒光強度並計算T/C值，儀器結合T/C值和二維碼上的標準曲線即可計算出樣品中待測物的含量。為滿足用戶的檢測需求，維德維康在研發時將實際檢測工作中的痛點問題納入考量，熒光定量快速檢測卡才有了無與倫比的檢測優勢：

①采用時間分辨熒光微球作為抗體標記物，檢測靈敏度更高;

②時間分辨熒光的Stokes位移約290nm，抗背景幹擾能力強;

③附帶的二維碼包含檢測項目、檢測樣本、檢測限等信息;

④40℃溫度層析，反應速度快，減少檢測時間，提高檢測效率;

⑤檢測結果穩定性高，可保證在5~10min層析時間內結果穩定。

4.3.3熒光免疫定量分析儀(FQ-S2)

熒光免疫定量分析儀(FQ-S2)有如下特點：

①儀器配置方麵，8寸1200×1920 IPS顯示屏和1.5GHz八核處理器，2G內存;

②操作係統方麵，熒光免疫定量分析儀的操作軟件支持自動檢測，在線升級;

③信號識別方麵，儀器可自動識別檢測卡上的二維碼信息，並進行檢測的結果計算;

④存儲空間方麵，存儲空間達16GB，可保存海量的檢測數據，便於結果查詢;

⑤數據傳輸方麵，檢測數據可通過無線WIFI實時傳輸到雲端數據監管平台;

⑥結果打印方麵，儀器自帶熱敏打印機，檢測結果可實時打印。

4.3.4 雲端數據監管平台

維德維康監測監管係統能與檢測儀器上傳的數據交互，利用互聯網技術實現檢測數據實時上傳，監管平台對檢測數據進行處理分析和分類彙總，可實現世界杯賽程預測關鍵點的信息化監控，構建省級、市級、區縣級的數據化、信息化監測監督體係，為管理者提供強大的係統數據支撐。