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米諾環素多克隆抗體的製備

2018-11-27 15:49:52 來源: 世界杯賽程預測 導刊

　　米諾環素又稱二甲胺四環素、美滿黴素、美諾星、康尼Minocycline、Minomycin、Klinomycin等，是一種高效、速效、長效的新半合成四環素類抗生素，其抗菌作用為該屬中最強，抗菌譜與多西環素相似，作用較四環素強2～4倍，也勝過多西環素、美他環素、土黴素。目前國內外有關米諾環素的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)薄層色譜法(TLC)以及毛細管電泳法(CE)，這些方法雖然檢測結果準確、靈敏度高,但是待測樣品前處理過程複雜、費時。免疫學方法基於抗原、抗體之間的特異反應,具有快速、靈敏、特異性強、操作簡單等特點，是殘留檢測的有效方法,不僅適用於大量樣品的快速篩選,某些情況下也可以用於確證性檢測。
　　米諾環素為小分子化合物，本身不具有免疫原性，運用免疫學方法進行檢測首先應將其與大分子蛋白質載體進行偶聯，產生所需的免疫原性。本文應用戊二醛法和重氮化法將米諾環素在適當的條件下與牛血清白蛋白(BSA)進行偶聯,合成了MNC完全抗原MNC-BSA，免疫動物後製成多克隆抗體，旨在為米諾環素殘留免疫學快速檢測方法的建立奠定基礎。
　　材料與方法
　　材料
　　米諾環素由中國藥品生物製品檢定所提供；新西蘭大白兔由沈陽市盛京醫院提供。
　　試劑與儀器
　　弗氏完全佐劑(CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA)sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)北京奧博星生物技術有限公司；戊二醛(GA)、考馬斯亮蘭G250、甲醇鈉-甲醇溶液均為分析純。
　　Model 68酶標儀Bio–Rad公司；TU-1810紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；RET BASIC磁力攪拌器德國IKA公司；LZG-02冷凍幹燥機康源保鮮技術發展公司；DNP–9162型恒溫箱上海精宏實驗設備有限公司。
　　米諾環素人工抗原的合成
　　戊二醛法合成法：稱取7.5mg MNC和34mg BSA分別溶於1ml超純水和10ml PBS（0.1mol/L pH=7.4的磷酸緩衝液），將MNC溶液在攪拌下加入BSA溶液，緩慢滴入0.2ml 25%戊二醛，攪拌4h,5000r/min離心10min，上清液於磷酸緩衝液（0.01 mol/L pH=7.4）中4℃下透析5d，每天換兩次透析液，透析完畢後冷凍幹燥，分裝，-20℃凍存，備用。
　　重氮化法合成法：稱取7.5mg溶解在5ml超純水中，加入8ml溴水堿液，4℃下預冷。避光向上述反應液中緩慢滴加1mol/L的鹽酸調pH值至2.5，4℃避光逐滴滴加1ml預冷的亞硝酸鈉貯備液到上述反應液，冰箱孵育1h，將重氮化的MNC按20：1比例慢慢加入BSA溶液，冰箱孵育24h，隨後於4℃下透析5d，每天換兩次透析液，透析完畢後冷凍幹燥，分裝，-20℃凍存，備用。
　　人工抗原的鑒定與結合比的測定
　　用磷酸緩衝液PBS配製適宜濃度的BSA與MNC標準液，適當稀釋後以PBS為空白，在波長200-500nm下對他們進行紫外掃描，繪製紫外吸收光譜曲線。按合成米諾環素完全抗原和包被抗原反應所用半抗原、載體蛋白與偶聯產物的比例，用紫外分光光度計掃描測定，按(1)式計算偶聯物的結合比。
　　（1）
　　式中：Ca／Cb—偶聯物中A、B兩種物質摩爾濃度比(結合比)；ACam、ACbm—偶聯物分別在A、B最大吸收波長下的吸光值；KAam、KBbm—A、B在各自最大吸收波長下的摩爾消光係數；KAbm—A在B最大吸收峰波長處的摩爾消光係數；KBam—B在A最大吸收峰波長處的摩爾消光係數。
　　抗體的製備與純化
　　選用2隻體重2kg左右的雄性新西蘭大白兔分別為1、2號兔進行免疫,共5次,免疫前采血作為陰性血清。首次免疫：將2mg/ml完全抗原與等量弗氏完全佐劑(CFA)充分乳化後進行皮下10點注射。加強免疫：每隔14d加強免疫一次,劑量不變,CFA換成弗氏不完全佐劑(IFA)。每次加強免疫一周後，耳緣靜脈采血，檢測效價。當效價達到一定水平，停止免疫7d後心髒穿刺采血，分離抗血清，並采用辛酸一硫酸銨二步沉澱法純化抗體，製成凍幹粉，於-20℃下保存備用。
　　抗體免疫活性的測定
　　抗體效價的測定
　　抗血清效價測定參照文獻，利用間接ELISA法測定免疫獲得的抗體效價。
　　工作濃度
　　采用方陣實驗法測定包被抗原和酶標抗體稀釋度，確定直接競爭ELISA法抗原和酶標抗體最適工作濃度。OD490值約為1.0，抗體-抗原用的濃度組合即為抗體-抗原的工作濃度。
　　抗體的特異性考察
　　參照上述間接ELISA法和方陣滴定法確定抗原抗體的最適工作濃度，在最佳工作條件下，用間接競爭ELISA法檢測MNC抗血清與氯黴素、鏈黴素、紅黴素、金黴素、土黴素、多西環素等其它抗菌素的交叉反應率。間接競爭ELISA法操作步驟與間接ELISA基本一致，不同的是封閉反應完成後加入的不是倍比稀釋的待測血清，而是將梯度稀釋的藥品溶液與固定濃度的抗血清混合，分別加入板孔中．以空白對照0 ng／mL MNC時的吸光值為B0，不同質量濃度MNC競爭後的吸光值為B，以B／B0為縱坐標，質量濃度(ng／mL)的對數為橫坐標，繪製標準MNC的抑製曲線，同時根據下列公式計算交叉反應率。
　　結果與分析
　　人工抗原的鑒定
　　半抗原MNC分別在波長222、252、273和348nm處有典型吸收峰。由圖1可以看出,戊二醛合成法合成的MNC-BSA的最大吸收峰由原來在278nm處呈最大吸收峰的BSA逐漸向252nm處偏移，直至波長266nm處。BSA的最大吸收波長為278nm，在300-400nm幾乎無吸收，而結合物的紫外光譜在300nm長波方向有明顯的吸收值，並且相同濃度的結合物和標準蛋白的紫外光譜相比較，吸光度明顯增加，光譜明顯具有MNC和蛋白疊加的特性。重氮化法合成的完全抗原也有相同的特性。以上結論表明兩種偶聯方法中米諾環素（MNC）和牛血清白蛋白（BSA）載體已經發生偶聯。
　　圖1戊二醛法和重氮化法合成的兩種完全抗原的紫外掃描光譜圖
　　人工抗原結合比的測定：
　　經計算戊二醛法與重氮化法半抗原與BSA的結合比分別人為9.9和5.9。兩種方法的偶聯比差異明顯，其中，戊二醛法的效果明顯好於重氮化法。所以采用戊二醛合成法合成的複合物為抗原進行動物免疫實驗。
　　多克隆抗體效價及工作濃度
　　用間接ELISA測定經免疫獲得的抗血清的效價為16000。經方陣實驗法測定包被抗原和抗體的稀釋度，確定直接競爭ELISA法中抗原和抗體的最適工作濃度分別為抗原2ug/ml、酶標抗體4ug/ml。
　　多克隆抗體的特異性考察
　　多克隆抗體的特異性鑒定：
　　在最佳的包被抗原與抗體濃度下，加抗體的同時加入米諾環素或其他結構類似化合物（土黴素、金黴素、多西環素、青黴素等），檢測米諾環素及類似物對獲得的米諾環素多克隆抗體的交叉反應情況。由表1可知，實驗獲得的抗體除與土黴素和多西環素和金黴素有交叉反應外，與其他化合物未見交叉，交叉反應率均小於0.1%。
　　米諾環素標準曲線的繪製
　　在優化的條件下對不同濃度的米諾環素標準液進行測定，以米諾環素質量濃度的對數值為橫坐標，抑製率為縱坐標作圖，即得其標準曲線（如圖2）
　　從標準曲線可以判定，在7.8～500ng/ml的濃度範圍內，米諾環素質量濃度的對數和抑製率成線性相關。其線性方程為Y=28.839x-12.97 R2=0.9874
　　根據回歸方程計算，IC50=152.6ng/ml其最低檢出限IC10=6.3ng/ml
　　結果與討論
　　目前,我國進出口食品中四環素類的殘留檢測采用的是高效液相色譜法,這種方法對被測樣品的前處理要求高,檢測的靈敏度不夠高,而免疫學檢測方法具有快速、靈敏等優點。在免疫學檢測中，抗原和抗體的製備是整個分析方法中最為關鍵的技術。本實驗分別采用戊二醛法和重氮化法，將載體蛋白與半抗原MNC進行偶聯，得到了完全抗原MNC-BSA，采用戊二醛法合成的抗原偶聯比達到10，而且用本法合成的完全抗原免疫兔，抗血清效價達到1:16000。
　　交叉實驗表明，米諾環素除對四環素類抗生素交叉反應較高外，對其他類似藥物均表現出較低的交叉反應性（<0.1），因此可應用於四環素類多殘留檢測。本文測定的最低檢測限為6.3ng·ml-1，遠低於動物性食品中米諾環素殘留標準，可滿足米諾環素殘留快速檢測的需要，並為後期單克隆抗體的製備和膠體金免疫層析法檢測奠定了基礎。
　　作者簡介：郭德超,男，工程師，碩士，主要從事食品檢驗工作。
　　郭德超鄭鳳娥杜翠榮王岩鬆霍曉雪
　　沈陽食品檢驗所
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