雙劍客！納米載體與細胞治療共擊癌症

納米載體.聯合用藥.細胞治療
隨著今年八月諾華CAR-T細胞治療商品Kymriah™靜脈輸注懸浮液獲FDA批準上市，作為一種新型的細胞免疫療法，利用患者自身免疫細胞對抗癌症，已為我們開啟了一個全新抗癌新篇章。利用細胞治療方法，對抗更多種類的腫瘤，包括實體瘤，如神經膠質瘤，是當前腫瘤免疫治療的熱點。目前CAR-T細胞治療，也存在不少瓶頸難題，如缺少腫瘤特異性靶點、on-target/off-tumor副作用、通用差和生產製備成本高等問題，而納米載體可通過“特洛伊木馬”效應，聯合其他治療手段，改善細胞治療中遇到的瓶頸難題。

案例一 中性粒細胞介導化療藥物抑製惡性腦膠質瘤術後複發
腦膠質瘤是顱內最常見的惡性侵襲性生長腫瘤，臨床治療常采用手術結合放/化療的方法。一線腦膠質瘤化療藥物替莫唑胺（Temozolomide, TMZ）可透過血腦屏障，但術後治療效果並不盡人意。而其他抗腫瘤藥物，如紫杉醇等，則因難以透過血腦屏障而不能應用於腦膠質瘤臨床治療。
2017年中國藥科大學張燦教授課題組在Nature Nanotechnology雜誌（影響因子38.986）上發表論文，借助脂質體納米載體，使用中性粒細胞治療與化療藥物紫杉醇（Paclitaxel, PTX）聯合治療腦膠質瘤，實現了高效自主引導的藥物靶向遞送，對原位腦膠質瘤小鼠模型術後的複發起到顯著抑製效果。
如上流程圖所示，，將紫杉醇PTX在體外包裹形成PTX-CL陽離子脂質體，與從小鼠體內分離的中性粒細胞（Netrophils, NEs）孵育，中性粒細胞將PTX-CL吞噬胞內形成細胞製劑（PTX-CL/NEs）。通過尾經脈注射將細胞製劑注入原位腦膠質瘤術後小鼠模型體內，細胞製劑透過血腦屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）到達腦膠質瘤區域。隨後被腫瘤區內高濃度炎症因子激活，形成胞外誘捕網（Neutrophil Extracellular Traps, NETs），將細胞製劑內的紫杉醇脂質體從細胞內釋放出來，被腦膠質瘤細胞攝取，從而發揮抗腦膠質瘤作用。
在3D膠質瘤細胞模型上，使用Cou6探針（綠色）標記脂質體納米顆粒，通過共聚焦光學切片觀察不同處理條件下的脂質體對3D細胞的浸潤情況， Cou6-CL/NEs複合體組能更好的侵入3D腫瘤細胞微球內部（上圖d）。在單層G422神經膠質瘤細胞模型上，通過Cou6探針（綠色）標記脂質體／DiR（紫色）標記中性粒細胞／Hoechst（藍色）標記所有細胞核／PI（紅色）標記死細胞，通過顯微成像觀察不同處理時間點，中性粒細胞釋放NETs及對G422膠質瘤細胞的殺傷情況，隨著時間的推移，8小時後中性粒細胞釋放Cou6，且被G422細胞內吞後造成細胞死亡（上圖e）。通過G422細胞存活實驗進一步驗證，PMA處理的細胞製劑（PTX-CL/NEs）與PTX-CL具有相當的腫瘤殺傷效果（上圖f）

在G422細胞原位接種腦膠質瘤小鼠術後模型上，使用DiR染料標記PTX-CL/NEs，通過小動物活體成像，監測PTX-CL/NEs在不同組織內的實時分布情況，進一步分析發現PTX-CL/NEs能有效透過血腦屏障到達腦部神經膠質瘤病灶區（上圖b/e）。從小鼠生存曲線來看，PTX-CL/NEs處理組與其他對照組相比能顯著提高治療效果（上圖f），且與病理切片免疫組化結果完全一致（上圖g）。

案例二 將CAR基因裝入納米載體，開啟納米CAR-T治療新方案

CAR-T 細胞治療過程複雜，需要分離提取T細胞—基因改造—體外培養—回輸體內等流程，過程繁瑣，存在多種安全隱患，且治療成本昂貴。2017年Tyerl T. 等人在Nature Nanotechnology雜誌上發表一種全新的納米CAR-T細胞治療新方案，該方法采用與傳統體外構建的完全不同的策略，將CAR基因裝入特殊納米載體後，直接將納米顆粒注入動物模型體內，納米載體攜帶CAR基因靶向進入T細胞後，在體內自動完成CAR-T細胞構建及治療。
這種全新的納米載體設計非常巧妙，納米顆粒內除了含有帶有關鍵CAR基因和GFP/Luc標記的基因以外，還組裝有高活性轉位酶基因（iPB7），用於後期體內CAR-T細胞自主構建。同時在納米顆粒外部，偶聯有CD3eF(ab̒)2抗體（黃色）可靶向白血病特異性T細胞。另外與CAR基因偶聯的GFP/luc（CBR-luc）雙報告基因，方便對納米載體在體內治療效果進行實時追蹤。

在白血病小鼠模型上，使用不同設計的納米載體與傳統體外組裝的CAR-T細胞治療同時進行治療對比，使用活體成像係統對治療效果進行長達84天的實時監測，發現含有P4-1BBz和iPB7基因的納米載體，能特異識別T細胞並自動完成CAR組裝，且與傳統體外組裝的CAR-T細胞治療具有相同的治療效果（上圖a-b）。