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多重PCR法在食品中致瀉大腸埃希氏菌質控考核中的應用

2018-05-30 15:29:14 來源: 世界杯賽程預測 導刊

　　摘要：目的 通過多重PCR方法檢測質控樣本中致瀉性大腸埃希氏菌 方法：參照GB4789.6-2016《世界杯賽程預測國家標準 食品微生物學 致瀉大腸埃希氏菌菌檢驗》進行檢驗，結果 編號15-1樣品檢出EHEC,15-2樣品檢出ETEC。本實驗室順利完成考核，結果與考核方一致。結論：多重PCR法在質控考核中，能夠對目標菌快速鑒別，能夠快速順利完成質控考核，同時了解該實驗室檢驗能力和實驗室質控水平，提高檢驗機構出具檢驗數據的可靠性和有效性，保證實驗室的檢測水平。
　　關鍵詞：質控考核；致瀉大腸埃希氏菌；多重PCR
　　1.引言
　　大腸埃希氏菌俗稱大腸杆菌，是人類和動物的腸道中重要的正常菌群，為宿主提供一些有營養作用的合成代謝產物。多數大腸埃希氏菌並不致病，當機體抵抗力下降或侵入腸外組織或器官時，可作為條件致病菌而引起腸道外的感染，引起胃腸炎的大腸埃希氏菌分為五類即腸致病性大腸埃希氏菌(EPEC)、腸產腸毒素大腸埃希氏菌(ETEC)、腸侵襲性大腸埃希氏菌(EIEC)、腸出血性大腸埃希氏菌(EHEC)和粘附性腸埃希氏菌(EAEC)[1]。快速檢測和鑒定病原菌是及時有效地控製與預防傳染病傳播的重要手段。傳統的微生物學分離與鑒定以及血清學方法在鑒別與鑒定病原微生物方麵日益顯現出不足。PCR法快速、敏感、特異，是對病原菌快速鑒別與分型的重要技術之一，而多重PCR更以其突出的優越性得到了廣泛的應用[2]。
　　2.材料與方法
　　2.1樣品
　　樣品編號為15-1,15-2，每份考核樣品包含西林瓶1個，西林瓶中裝有白色凍幹菌球。本次考核共計2份樣品。
　　2.2試劑及儀器
　　營養肉湯、腸道菌增菌肉湯、麥康凱瓊脂(MAC)、伊紅美藍瓊脂(EMB)、三糖鐵(TSI)瓊脂、大腸埃希氏菌生化套盒、無菌雙蒸水，以上試劑均使用北京路橋。五種致瀉大腸埃希氏菌DNA提取試劑盒、多重PCR及實時熒光PCR試劑盒均使用北京卓誠惠生，實時定量PCR儀器（BIO-RAD公司），凝膠成像儀（BIO-RAD公司），電泳儀。
　　2.3試驗方法
　　按照GB4789.6-2016《世界杯賽程預測國家標準 食品微生物學 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》[2]開始檢測。
　　2.3.1樣品前處理與預增菌
　　待質控樣品恢複至室溫，無菌開啟瓶蓋，將西林瓶中的白色菌球完全溶解於50mL無菌生理鹽水中,作為樣本。
　　2.3.2以無菌操作量取檢樣25mL，加入裝有225mL營養肉湯的無菌袋中，振蕩混勻。將營養肉湯增菌液放置於36℃培養18h（增菌時間延長）。取1mL（加樣量增大）,接種於30mL腸道菌增菌肉湯管內，於42℃培養18h。
　　2.3.3分離
　　將增菌液劃線接種MAC和EMB瓊脂平板，於36℃培養24h，觀察菌落特征。
　　2.3.4生化鑒定
　　選取平板上10個可疑菌落,分別接種TSI斜麵。同時將這些培養物分別接種蛋白腖水、尿素瓊脂(pH7.2)、KCN肉湯和營養瓊脂平板，於36℃培養24h。
　　2.3.5PCR確證試驗
　　使用1μL接種環刮取營養瓊脂平板上的菌落，懸浮於200μL滅菌雙蒸水中，充分打散製成菌懸液，13000r/min離心3min，棄掉上清液。加入50μL充分震蕩混勻的核酸提取液，於100℃金屬浴維持10min，13000r/min離心3min，收集上清液，取2μL作為PCR檢測的模板。
　　3.結果與分析
　　4.討論與分析
　　本實驗室自2014起，參與國家食品風險監測項目，並開始使用多重PCR技術，對五種致瀉大腸埃希氏菌進行檢測。GB4789.6-2016自2017年6月23日執行以來，也是食品微生物學檢驗係列國標中，首個細菌使用PCR做確證的標準。河南省疾病預防控製中心對全省各地市進行了質控考核，了解各實驗室對該技術掌握的程度以及實驗室檢測水平。
　　傳統的血清學分型，操作繁瑣，技術人員要求高，且檢驗結果並不能作為是否有致病能力的依據，隻能說某個血清型可能與致病相關。血清學鑒定的137株致瀉大腸中僅有15株（10.9%）為正確鑒定，僅采用血清學分類是不夠的[3]。與傳統血清試驗相比較而言，用PCR方法進行確證，操作簡單，對操作人員要求不高，且提高致病菌檢出率及檢驗的準確性，同時縮短了致病菌的檢驗時間。隨著快速檢驗方法的發展，快速檢驗因其優點快速發展，在突發公共衛生事件的處理中，發揮積極作用，但快速方法也存在其缺點，快速檢驗一般從基因著手，檢測到致病菌並未獲得其菌株，容易產生假陽性結果。因此，在麵對突發公共衛生事件時，應該靈活運用，將快檢方法與傳統方法相結合，快速準確地得出實驗室結果，為相關部門處理問題提供可靠依據。該實驗室在此質控過程中使用了兩種多重PCR方法來進行確證試驗，相互印證結果，兩種方法實驗結果一致。實時熒光多重PCR優點在於將PCR擴增與結果判定結合一起，操作簡單，耗時短，汙染少。普通PCR試驗後，需要進行電泳試驗並用凝膠成像儀觀察結果，操作繁瑣，試驗過程耗時長，存在汙染環境風險[4]。
　　參考文獻
　　[1]李凡,劉晶星.醫學微生物學(第七版)[M].北京:人民衛生出版社,2012.
　　[2]世界衛生組織.麻疹實況報道.2017－03.
　　[3]GB4789.6-2016《世界杯賽程預測 國家標準食品微生物學致瀉大腸埃希氏菌菌檢驗》[s].
　　[4]JYang,FJWu,JMu,LLin,etal.ComparisonbetweenOSerotypingMethodandMultiplexReal-TimePCRToIdentifyDiarrheagenicEscherichiacoliinTaiWan[J].《JournalofClinicalMicrobiology》,2007,45(11):3620-3625
　　史曉娟 魏紅霞 新鄉市疾病預防控製中心
　　賀海花 新鄉市結核病防治所
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