HPLC法測定麵包中 丙酸鈣含量的不確定度評定

測量不確定度是與測量結果相聯係的參數，本文通過采用HPLC法測定了麵包中丙酸鈣的含量，並對其相對擴展不確定度進行了評定。
丙酸鈣作為防腐劑可以添加在焙烤類食品中，限量為2.5g/kg(以丙酸計)。高效液相色譜法(HPLC)是測定食品中丙酸鈣的國家標準方法。測量不確定度是與測量結果相聯係的參數，用於表征賦予被測量之值的分散性。當測量結果處於臨界值時食品檢驗機構必須進行測量不確定度評定。本文對HPLC法測定麵包中丙酸鈣含量的不確定度因素進行了評定，計算出不確定度並報告了結果。

1 儀器、試劑、色譜分析條件
1.1 儀器
高效液相色譜儀，島津LC-20AT，附紫外檢測器和自動進樣器；高速冷凍離心機，北京雷勃爾LR10-2.4A；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器KQ-100；高速組織搗碎機，上海精科DS-1；pH計,上海儀電科學PHS-3C；電子天平，上海上天FA2004；溶劑過濾器及0.45μm微孔濾膜。

1.2 試劑
分析純磷酸（H ₃PO ₄）、分析純磷酸氫二銨[(NH ₄) ₂HPO ₄]、實驗室用超純水、 食品添加劑丙酸鈣純度標準物質(GBW(E)100078)。

1.3 色譜分析條件
色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq 4.6×250mm,5μm,P.N.880975-914；流動相：1.5g/L；磷酸氫二銨溶液,用1mol/L磷酸溶液調pH為3.0(使用時配製)；經0.45μm微孔濾膜過濾；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；進樣量：10μL；紫外檢測器波長：214nm。
2 樣品處理與標準溶液曲線的繪製
依據國家標準GB 5009.120-2016進行試驗。

2.1 樣品製備
將麵包樣品經組織搗碎機搗碎混勻，準確稱取以上樣品5g（精確至0.0001g）至100mL燒杯中，加水20mL，加入1mol/L磷酸溶液0.5mL，混勻；經超聲浸提10min後，用1mol/L磷酸溶液調pH為3左右，轉移試樣至50mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。將試樣全部轉移至50mL具塞塑料離心管中，以不低於4000r/min的速度離心10min，取上清液，經0.45μm微孔濾膜過濾後，待液相色譜測定。

2.2 標準曲線的繪製
準確吸取5.0mL丙酸標準貯備液(10mg/mL)於50mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,配製成濃度為1.0mg/mL標準工作液。再準確吸取標準工作液0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL至10mL容量瓶中，分別加入1mol/L磷酸0.2mL，用水定容至10mL，混勻。其丙酸標準溶液的最終濃度分別為0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL,經0.45μm微孔濾膜過濾，濃度由低到高進樣分析，以濃度為橫坐標，以峰麵積為縱坐標，繪製標準曲線。
3 測量數學模型
樣品中丙酸鈣含量(以丙酸計),按式（1）計算: 式中:
X為樣品中丙酸鈣的含量(以丙酸計),單位為克每千克(g/kg)；c是由標準曲線得出的樣液中丙酸的濃度,單位為毫克每毫升(mg/mL)；V是樣液最後定容體積,單位為毫升(mL)；m為樣品質量,單位為克(g)；f是稀釋倍數。
注：試樣中測得的丙酸含量乘以換算係數1.2569，即得丙酸鈣含量。計算結果保留3位有效數字。
4 根據數學模型分析影響不確定度的因素
不確定因素有以下幾方麵：①樣品稱量引起的不確定度；②樣品平行測定引起的不確定度；③樣品定容引入的不確定度；④標準係列溶液配置引起的不確定度；⑤標準曲線擬合引入的不確定度。
5 不確定度評定
5.1 樣品稱量引起的不確定度(B類不確定度)
本試驗所用電子天平為萬分之一，最小分度值為0.1mg,由校正證書查得天平重複性標準差0.3mg，天平重複性標準差應計算為2次。則 稱樣量為5.0026g，相對不確定度為：U _rel(m ₁)=u(m ₁)/m=0.00043/5.0026=8.6× 10 ^-5；

5.2 樣品平行測定引起的不確定度（A類不確定度）
試驗中對同一樣品丙酸鈣的含量進行了3次平行測定其結果分別為：1.08g/kg、1.07g/kg、1.10g/kg，平均值 =1.08g/kg,標準偏差= =0.0158g/kg,
按均勻分布計算，其不確定度為U _A=0.0158/ =0.0091g/kg，則相對不確定度為U _rel(A)=UA/ =0.0091/1.08=8.4×10 ^-3；

5.3 樣品定容體積引入的不確定度（B類不確定度）
20℃時50mL A級容量瓶的允許誤差為±0.05mL,按均勻分布計算，由此帶來的不確定度為u=0.05/ =0.0289mL；50mL A級容量瓶重複充液2次，用極差計算，其極差為R=0.015mL，由極差係數C及自由度υ,則充液帶來的不確定度為0.015/1.13=1.3 ×10 ^{- 2}mL；試驗溫度為20±2℃，水的體積在20℃膨脹係數為2.1× 10 ^-4，溫差變化引起體積的變化為：50 ×2 ×2.1× 10 ^-4=0.021mL，按均勻分布計算，溫度變化引起的不確定度為：0.021/ =0.0121mL。
則樣品定容引入的相對不確定度U _rel(v ₁)= /50=6.8 ×10 ^-4。

5.4 標準係列溶液配製引入的不確定度(B類不確定度)
5.4.1 標準儲備液引入的不確定度
①丙酸鈣標準品的純度，證書上給出的純度99.7%，不確定度為0.6%，則標準物質引入的不確定度0.006/ =0.0035。
②本試驗所用電子天平為萬分之一，最小分度值為0.1mg,由校正證書查得天平重複性標準差0.3mg，天平重複性標準差應計算為2次。則u(m ₂)= =0.00043(g),稱標準品為0.3146g，則由稱量引入的相對不確定度為：0.00043/0.3146=0.0014。
③標準物質稀釋引入的不確定度
a.20℃時25mL A級容量瓶的允許誤差為±0.03mL,按均勻分布計算，由此帶來的不確定度為0.03/ =0.0173mL。
b.25mL A級容量瓶重複充液2次，用極差計算，其極差為R=0.015mL，由極差係數C及自由度υ,則充液帶來的不確定度為0.015/1.13=1.3 ×10 ^-2mL。
試驗溫度為20±2℃，水的體積在20℃膨脹係數為2.1 ×10 ^-4，溫差變化引起體積的變化為：25× 2 ×2.1× 10 ^-4=0.0105mL，按均勻分布計算，溫度變化引起的不確定度為：0.0105/ =0.0061mL。則標準儲備液由稀釋引入的相對不確定度：U _rel(v ₂)= /25=0.0009，由此，丙酸鈣標準儲備液引入的不確定度為：U _rel(標儲)= =0.0039。
5.4.2 標準係列溶液由稀釋引入的不確定度
①由5mL A級單標移液管引起的相對不確定度來自三個分量
a.5mL A 級單標移液管引的容量誤差查證書為±0.015mL，按均勻分布，不確定度為0.015/ =8.7× 10 ^{- 3}(mL)。
b.5mL A級單標移液管的充液重複性引起的不確定度，重複充液兩次，用極差計算，其極差為R=0.015mL,由極差係數C及自由度υ，則由充液引入的不確定度為0.015/1.13=0.013(mL)。
c.試驗溫度變化為±2℃，水的體積在20℃膨脹係數為2.1×10 ^-4，按均勻分布，由溫度變化引入的不確定度為2.1×10 ^-4×5× 2/ =0.0012(mL)，則5mL A級單標移液管體積引入的不確定度為 =0.016(mL)，由此，5mL A級單標移液管體積引入的相對不確定度為0.016 /5.00=0.0032。
②標液定容體積引入的不確定度
a. 50mL A級容量瓶體積引入的相對不確定度。
a ₁.20℃時50mL A級容量瓶的允許誤差為±0.05mL,按均勻分布計算，由此帶來的不確定度為0.05/=0.0289mL。
b ₁.50mL A級容量瓶重複充液2次，用極差計算，其極差為R=0.015mL，則充液帶來的不確定度為0.015/1.13=1.3×10 ^-2mL。
c ₁.試驗溫度為20±2℃，水的體積在20℃膨脹係數為2.1×10 ^-4，溫差變化引起體積的變化為：50×2×2.1×10 ^-4=0.021mL，按均勻分布計算，溫度變化引起的不確定度為：0.021/ =0.0121mL。
由此，50mLA級容量瓶體積引入的相對不確定度為U _rel(v ₂)= /50=6.8 ×10 ^-4
b.10mL A級容量瓶體積引入的相對不確定度
a ₁.20℃時10mL A級容量瓶的允許誤差為±0.02mL,按均勻分布計算，由此帶來的不確定度為0.02/ =0.0115mL。
b ₁.10mL A級容量瓶重複充液2次，用極差計算，其極差為R=0.015mL，由極差係數C及自由度υ，則充液帶來的不確定度為0.015/1.13=1.3×10 ^-2mL。
c ₁.試驗溫度為20±2℃，水的體積在20℃膨脹係數為2.1×10 ^-4，溫差變化引起體積的變化為：10×2×2.1 ×10 ^-4=0.0042mL，按均勻分布計算，溫度變化引起的不確定度為：0.0042/ =0.0024mL。
由此，10mL A級容量瓶體積引入的相對不確定度為：U _rel(v ₄)= /10=1.75×10 ^-2
至此，標準係列溶液由稀釋引入的不確定度：Urel(v ₅)= =0.018

5.5 標準曲線擬合引起的不確定度
采用7個濃度水平丙酸鈣標準溶液，得出峰麵積，用最小二乘法擬合，得到標準曲線
Y=175471x+2485.6，本試驗對同一樣品進行了3次測量，求得平均值 =1.08g/kg，因此由標準曲線擬合帶來的標準不確定度為：

式中：SR回歸曲線的剩餘標準差，b為斜率，p為待測樣品的重複測定次數(p=3),n為回歸曲線的點數n=7， c待測樣品濃度的平均值， c ₀為回歸曲線各點濃度的平均值， c _0i為各標準溶液濃度值。



由上述表中數據計算出SR回歸曲線的剩餘標準差，即：



擴展不確定度：取p=95%，k _p=2，則U=u _ck=0.025×2=0.05g/kg
報告結果：1.08±0.05g/kg(k=2)
不確定度表達測量結果的分散程度，是一個定量的概念，可以用定量的數字描述。本文對HPLC法測定麵包中丙酸鈣含量的不確定度因素進行了評定，若檢測結果處於標準限量的臨界值或標準方法有要求時，必須結合不確定對檢測結果進行評判。