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動物源性食品鴨血中鴨成分普通PCR檢測方法探究

2018-03-27 12:17:52 來源: 世界杯賽程預測 導刊

　　摘要：研究鴨血因DNA部分降解而使普通PCR檢測結果偏離的優化方法。對普通PCR方法未檢出但實時熒光定量PCR方法檢出的鴨血DNA通過增加擴增模板量到5uL，擴增產物稀釋100倍進行二次擴增，可以得到的DNA純度較高，凝膠電泳條帶明亮，背景清晰，改進的方法能使普通PCR方法檢測結果準確性提高，降低假陰性概率。
　　關鍵詞：鴨血，普通PCR檢測，假陰性，鴨血DNA，二次擴增
　　鴨血的營養價值很高，含有豐富的蛋白質、多種微量元素（如鐵、銅、鈣等），有補血和清熱解毒的作用，並有預防和治療缺鐵性貧血的功效。鑒於如此的食用功效，且鴨血液量相對於體積龐大的動物血量相對較少，因此鴨血的價格明顯偏高，部分商家為了盈利可能會在鴨血中摻雜豬血甚至其他動物血來銷售。以DNA為基礎的PCR技術廣泛被用來鑒定食品中的動物源性成分[1]，由於血液保質期短，在加工製作的過程中會加入鹽和凝固劑[2]等化學物質，加之在提取鴨血DNA過程中的物理作用等會對DNA造成破壞，使DNA含量降低而使檢測結果有偏差。
　　目前檢測鴨成分的方法有普通PCR法和實時熒光定量PCR法，國家檢測鴨成分的唯一標準SN/T 3731.5-2013《食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法第5部分：鴨成分檢測PCR法》是用普通PCR法，實時熒光定量PCR法是不同的試劑盒公司開發出來的用於科研用方法，暫無實時熒光定量PCR法檢測鴨成分的國家檢測標準。熒光定量PCR在靈敏度、準確度、便捷性上均高於普通PCR，但對於需要出具第三方檢測報告的單位和企業，隻能用國家標準進行檢測，本文對SN/T 3731.5-2013檢測鴨血樣品中鴨成分因鴨血DNA部分降解而導致結果偏離進行了方法優化探索，以提高檢測結果的準確性。
　　材料與方法
　　材料與試劑鴨血：購自南京某大型超市。
　　DNA提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0、TaKaRa Taq(5U/uL)、10×PCR Buffer(Mg2+plus)、dNTP Mixture(各2.5mM)、PCR體係預混液Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)寶生物工程(大連)有限公司。
　　儀器和設備：EPS 300電泳儀Tanon；Universal GenoSens1800凝膠成像儀：上海勤翔；ABI 2720普通PCR儀：美國賽默飛；PikoREAL 96實時熒光定量PCR儀(96孔板)：美國賽默飛。
　　引物：參照標準[3]合成擴增鴨源性成分的引物，引物序列見標準[3]表1。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。
　　DNA提取方法：鴨血DNA提取方法按照DNA提取試劑盒的方法步驟進行提取。
　　普通PCR檢測：鴨血中鴨成分檢測步驟見SN/T 3731.5-2013[3]。
　　實時熒光定量PCR檢測：將鴨血所提DNA進行鴨源性成分的實時熒光定量PCR檢測，PCR反應體係為：預混液20μL，包括DNA模板1.6uL，Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）10uL，上下遊引物各0.4uL，Probe 0.8uL，加ddH2O補足20uL。
　　鴨成分實時熒光定量PCR反應條件為：95℃預變性30s；PCR反應：95℃5s，60℃30s，進行40個循環。根據擴增曲線Ct值≤35視為檢出鴨成分。
　　增加模板進行擴增檢測：將鴨血DNA添加不同模板量進行擴增，即PCR反應體係中DNA模板分別添加1uL、2uL、5uL、10uL，反應體係和反應條件見SN/T 3731.5-2013[3]。擴增產物進行電泳檢測。
　　二次擴增：將1.7擴增後的產物取2uL加入98uL ddH2O進行100倍稀釋，取1ul作為模板進行二次擴增，反應體係和反應條件見SN/T 3731.5-2013[3]。擴增產物進行電泳檢測。
　　結果與分析
　　鴨血樣品普通PCR和實時熒光定量PCR檢測結果：對提取的鴨血DNA利用鴨源性引物進行PCR擴增，反應產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，結果見圖1。對提取的鴨血DNA利用鴨源性引物進行實時熒光定量PCR，結果見圖2。
　　由圖1可知，空白對照和陰性對照無條帶產生，陽性對照在226bp有條帶產生，鴨血DNA擴增後在226bp位置無可見條帶，未檢出鴨成分。由圖2可知，實時熒光定量PCR檢測結果空白對照和陰性對照均為未檢出，陽性對照Ct值分別為18.26，檢出鴨成分，鴨血兩個平行樣Ct值分別為23.21/23.95，檢出鴨成分。普通PCR與實時熒光定量PCR檢測結果不一致，可以推測鴨血中鴨DNA可能受物理、化學等因素的影響，核酸有降解。
　　由圖3可以看出，添加鴨血模板量1uL、2uL、5uL、10uL，每個模板梯度各2個平行樣，擴增後都是Smear，陽性對照條帶正常而且很亮，排除了反應體係及引物的原因。因為鴨血與鴨肉不同，血液的保存期短，儲存不了太長時間，基因組降解可能性大。
　　二次擴增檢測結果：由圖4可以看出，對鴨血DNA添加不同模板量1uL、2uL、5uL、10uL擴增後的產物，經過1.8步驟進行二次擴增後，空白對照和陰性對照無條帶產生，陽性對照在226bp有條帶產生，不同模板添加量1uL、2uL、5uL、10uL二次擴增的擴增產物，2uL模板添加量在226bp位置有弱條帶，5uL和10uL模板添加量在226bp位置有明亮條帶，無非特異性條帶，擴增結果良好。
　　通過增加模板DNA量至5uL後擴增，可以增加目的DNA的含量，通過稀釋後，可以降低雜質的含量從而增加目的DNA的含量，提高擴增目的DNA的準確度。目前普通PCR法是國家現有的檢測鴨成分的唯一標準方法，是需要出具正式檢測報告的檢驗檢測機構的唯一檢測方法，而普通PCR法有很大的局限，檢測結果不夠準確，如果單以SN/T 3731.5-2013方法檢測鴨源性成分，可能得到錯誤的檢測結果，因此通過此優化方法來優化檢測過程，可以提高檢測結果的準確度，可為質檢部門及第三方檢測機構推廣應用，作為實驗室檢測血液類食品的常規檢測手段。
　　參考文獻
　　[1]全國文獻工作標準化技術委員會.SN/T 1119-2002進口動物源性飼料中牛羊源性成分檢測方法-PCR方法[S].北京：中國標準出版社，2002.
　　[2]邵碧英，楊婕，張體銀.動物產品的DNA提取方法[J].畜牧與獸醫，2005，37(9)：47-49.
　　[3]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.SN/T 3731.5-2013食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法-第5部分：鴨成分檢測-PCR法[S].北京：中國標準出版社，2013.
　　徐慧馬慧娟
　　作者簡介：
　　徐慧，碩士研究生，高級工程師，實驗室技術負責人，江蘇省理化測試中心。
　　馬慧娟，江蘇省理化測試中心。
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