乳及乳製品中卡那黴素殘留快速檢測產品應用

1 卡那黴素的檢測現狀
卡那黴素(Kanamycin)是一種氨基糖苷類抗生素，具有很強的抑菌作用，因價格低廉且抗菌性廣，而作為獸藥被廣泛使用。然而，在動物實際養殖過程中，濫用卡那黴素的現象屢見不鮮，造成其在動物源性食品中存在殘留，尤其是在乳品中的殘留現象更為嚴重。過量的卡那黴素可給人體帶來嚴重的副作用，主要包括腎毒性、造血係統毒性、過敏性等。另外，卡那黴素對嬰幼兒有很強的耳毒性，會導致嬰幼兒耳蝸細胞凋亡，嚴重者會造成聽力喪失。因此，嚴格控製卡那黴素在乳品中的殘留對保障乳品安全，維護消費者健康意義重大。
由於我國農業部發布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》（農業部公告第235號）發布時間較早，所以公告中並未規定卡那黴素的限量要求。參照歐盟獸藥殘留限量標準，卡那黴素在乳品中的最高殘留限量為150μg/kg，因此可預測我國的獸藥殘留限量標準修訂會參考歐盟的限量標準對卡那黴素限量進行嚴格把控。目前，檢測卡那黴素藥物殘留最普遍的方法為實驗室檢測方法，即儀器方法，如高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、液相色譜－質譜聯用技術（LC-MS）等。雖然此類檢測方法靈敏度高，但操作複雜，耗時較長，價格昂貴，因此也限製了其在現場實際的應用，故建立一種快速、靈敏、便捷的食品中卡那黴素的檢測方法對於保障 世界杯賽程預測很有必要。
北京維德維康生物技術有限公司（以下簡稱“維德維康”）基於前期深厚的研發基礎，研製出一係列卡那黴素快速檢測產品，包括卡那黴素酶聯免疫試劑盒、卡那黴素膠體金快速檢測試紙條等產品，可實現生鮮乳、原奶、奶粉、成品奶等多種質地乳品產品的快速定量、定性檢測，覆蓋乳品生產加工全產業鏈，可滿足多層次用戶的檢測需求。其中膠體金快速檢測試紙條操作簡單、檢測速度快，5min即可判讀檢測結果；酶聯免疫試劑盒反應靈敏，檢測限低至0.3μg/kg，達到行業領先技術水平。
2 卡那黴素酶聯免疫檢測體係
2.1 卡那黴素酶聯免疫試劑盒檢測原理
酶聯免疫吸附測定法是將已知抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應板）表麵，使酶標記的抗原抗體反應在固相表麵進行，用洗滌法將液相中的遊離成分洗除，加入底物顯色，顯色反應可通過ELISA檢測儀進行定量測定，這樣就可將酶化學反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。
維德維康基於酶聯免疫吸附測定法的原理，研製了卡那黴素酶聯免疫試劑盒，用於快速檢測乳品中卡那黴素藥物殘留。檢測樣品中的卡那黴素與酶標板上固定的抗原特異性競爭抗體，加入酶標記物，催化底物顯色，根據顯色的深淺來判斷樣品中卡那黴素的含量：顯色深，含量少；顯色淺，含量多。
2.2 卡那黴素酶聯免疫檢測體係的組成
卡那黴素酶聯免疫檢測體係由卡那黴素酶聯免疫試劑盒和酶標儀兩部分組成，酶聯免疫試劑盒具有配套的96孔酶標板，板內包被維德維康自主研發的卡那黴素抗原物質，可與卡那黴素抗體特異性結合，敏感性強；試劑盒內配有酶標記物工作液，通過催化作用使底物顯色，根據顯色深淺可進行定量檢測。酶標儀中內置標準曲線，可讀取定量檢測結果。
2.3 卡那黴素酶聯免疫檢測體係的優點
2.3.1 樣本前處理簡單快速：稱取1g乳製品樣本於離心管中；加入1mL 1%的三氯乙酸，震蕩離心5min；取50μL中間層清液於2mL離心管中；加入950μL樣品稀釋液，充分混勻；待測。
2.3.2 “一步法”檢測步驟：將板條插入酶標板架上，依次加入50μL樣品溶液、酶標記物工作液和抗體工作液；避光反應30min；充分洗滌，立即加入100μL底物溶液，避光反應15min；終止反應，用酶標儀在雙波長450nm、630nm下讀取酶標板吸光度值，即可得出定量檢測結果。
2.3.3 檢測結果準確：隨機選取3批卡那黴素酶聯免疫試劑盒進行驗證，結果證實，試劑盒在生鮮乳、原奶、奶粉、成品奶等多種類型樣本中的檢測限均可達到10μg/kg，添加回收率為70%~118%，批內批間變異係數均不超過10%。以《GB/T 22969-2008奶粉和牛奶中鏈黴素、雙氫鏈黴素和卡那黴素殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》中的液相色譜—串聯質譜法的檢測結果作為認定值，與卡那黴素酶聯免疫試劑盒檢測結果相比較，結果顯示，兩種方法的符合率達到99.5%以上，符合國家標準規定的檢測範圍。
3 卡那黴素膠體金免疫層析
快速檢測體係
3.1 卡那黴素膠體金免疫層析快速檢測體係原理
利用間接競爭原理，待測物和T線標記的抗原共同競爭金標抗體，根據膠體金試紙T線的顯色情況，來定性判斷待測樣品中是否含有目標化合物。檢測試紙條含有被事先固定於硝酸纖維素膜上的測試區（T）的抗原和控製區（C）的Ⅱ抗。微孔中的金標抗體經奶樣溶解後，50℃孵育3min，將試紙條插入金標微孔中反應5min，根據T區、C區的顏色深淺對比判讀結果。 3.2 卡那黴素膠體金免疫層析快速檢測體係的組成
卡那黴素膠體金免疫層析快速檢測體係由卡那黴素試紙條、金標微孔和孵育器3部分組成，試紙條上具有檢測線（T線）和質控線（C線），分別固定有抗原和Ⅱ抗，能夠特異性結合金標抗體，靈敏度高；金標微孔內裝有膠體金標記的抗體；孵育器為保溫裝置，可促進樣本溶液流動並控製合適的反應溫度。各部分組成如圖1所示。
3.3 卡那黴素膠體金免疫層析快速檢測體係的優點
3.3.1 前處理簡單：膠體金免疫層析體係無需複雜的前處理，對於生鮮乳、原奶、成品奶等液態產品，隻需充分搖勻即可檢測；對於奶粉等樣本，用去離子水溶解後也可直接檢測。
3.3.2 操作簡單：檢測時，吸取200μL奶樣於金標微孔中，小心吹打至紫紅色顆粒溶解，置於50℃孵育器內孵育3min，將試紙條插入金標微孔中，反應5min，取出試紙條即可判定檢測結果。全程檢測在10min內完成，反應時間快；無需額外有機化學試劑，綠色環保無汙染；操作簡單，無需專業培訓，適合基層檢測單位、質監部門現場快速監測及企業常規質檢。
3.3.3 判讀精確：對於原奶和奶粉樣本，卡那黴素快速檢測試紙條檢測限可達到3μg/kg，與目前歐盟獸藥殘留限量標準製定的限量值（150μg/kg）相比，靈敏度更高。同時，經大量實驗驗證，該產品的假陽性率可控製在3%以內，假陰性率低於1%；能夠實現準確判讀。
3.3.4 包裝小巧，便於攜帶：試紙條采用封閉包裝，可有效避免環境中汙染物質汙染試紙條，影響檢測結果。試紙條保存溫度在20±5℃之間，即開即用，且有效期為12個月，適用於車間、市場、養殖場等多種檢測環境，能夠滿足一線檢測的需求。
4 結論
卡那黴素快速檢測係統，包括卡那黴素酶聯免疫試劑盒、卡那黴素膠體金快速檢測試紙條等產品均具有檢測準確度高、操作簡單、便於攜帶的優勢，能夠實現生鮮乳、原奶、奶粉等多種乳及乳製品中卡那黴素殘留的快速檢測，填補了國內卡那黴素快速檢測的空白，防止卡那黴素殘留超標產品上市對消費者造成危害。同時，卡那黴素快速檢測係統的使用和推廣將有效提升各應用地區的乳品檢測技術手水平，切實解決一線檢測單位及生產企業經費不足、專業性差的問題，滿足各級質檢單位、乳品生產加工企業的檢測需求，促進乳品產業鏈向著健康安全的方向發展。
基金項目：石家莊市科學技術研究與發展計劃（151490072A）支持。