Veriflow與FDA和USDA方法對食品樣品中沙門氏菌檢測的比較

    摘　要：Veriflow^?檢測係統是一種基於分子生物學的測定方法，可準確檢測乳製品、肉製品、整雞淋洗液和即食食品中的沙門氏菌。該檢測方法將PCR檢測與快速、可視化的垂直流層析法相結合，不需要純化樣品、凝膠電泳或基於熒光素擴增目標菌，後期沒有複雜的數據分析過程。針對8個不同的食品和環境基質的檢測結果表明：對於含量極低的沙門氏菌（人工接種或自然存在），Veriflow沙門氏菌檢測（SS）都表現出很高的檢測靈敏度。通過對檢測結果陽性率的統計分析發現，Veriflow檢測結果與FDA微生物分析手冊BAM的方法和美國農業部世界杯赛程预测 與檢驗局微生物實驗室方法USDA/FSIS MLG的結果沒有顯著差異。包容性、排他性、性能穩定性等研究結果均表明Veriflow SS是一款穩定、可靠的產品，能高靈敏性、高選擇性、高包容性地檢測環境表麵、乳製品、肉、整雞淋洗液和各類即食食品中的沙門氏菌。
    關鍵詞：沙門氏菌屬　Veriflow　包容性　排他性　靈敏度
引言
    致病菌帶給企業和消費者的危害不言而喻，各國政府和企業都對食源性致病菌的快速診斷寄予厚望，這也使各種檢測方法層出不窮。美國Veriflow DNA簽名捕獲技術的致病菌、腐敗菌檢測係統，以其快速、準確、可視化等特點在各種檢測方法中獨樹一幟，是一項具有創新性的分子檢測技術，即使在未經淨化處理的樣品基質中也能高靈敏、高精確的檢測目標菌。 1 材料和方法
1.1 材料
    a.標準菌株：性能穩定性和批間穩定性測試中陽性樣本和陰性樣本的培養物，分別采用鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028）和枸櫞酸杆菌（ATCC 8090）；包容性和排他性測試菌株分別采用104株不同血清型沙門氏菌菌株和35株非沙門氏菌。
    b.樣品基質：生牛肉(20%的脂肪)、牛奶(2%的脂肪)、整雞淋洗液、熱狗。
1.2 Veriflow沙門氏菌（SS）檢測原理和檢測流程
    Veriflow SS是一種基於PCR和DNA簽名捕獲技術的檢測方法，將PCR與DNA簽名探針和垂直層析流係統相結合，能夠提供特異的、高靈敏度的靶標分子簽名檢測和快速、易解的檢測結果。
    本研究中，對各種基質進行采樣、增菌和PCR擴增，獲得沙門氏菌屬的特異性擴增產物。然後將PCR擴增產物直接滴加到層析卡盒的樣本視窗裏，再加入4滴緩衝液，僅需3分鍾即可產生反應信號。拉動檢測卡盒上的開關，觀察檢測結果。出現一條紅色質控線，表示層析卡盒工作正常。質控線和檢測線都出現表示沙門氏菌屬陽性，而隻出現質控線，則表示為陰性結果（如圖1所示）。 1.3 穩定性驗證研究
    性能穩定性（魯棒性）驗證研究：目的是評估Veriflow SS PCR操作步驟中的微小改變（樣本煮沸時間、緩衝液滴加量或層析卡盒反應時間）是否能影響其檢測性能（如表1）。     批次間穩定性驗證研究：選擇2013年9~10月間的3個批次Veriflow SS檢測係統，批號依次為ML 0025、ML 0028和ML 0029，在放置0、6和12個月的時間點進行實驗（如表2所示）。每個批次對應的時間點，各用10個陽性樣本和5個陰性樣本。     包容性和排他性研究：用Veriflow SS檢測104株沙門氏菌屬菌株和35株排他性菌株。
1.4 Veriflow SS與FDA推薦沙門氏菌檢測方法對比
    食品基質檢測方法比較：不同的食品基質接種不同血清型的沙門氏菌，食品基質的每個樣品中均加入稀釋24h的肉湯培養物，充分混合，在4℃下平衡48~72h。通過3種檢測濃度下的陽性樣品個數，來計算MPN。
    整雞胴體檢測方法比較：實驗開始前兩批各20個樣本一直保存在4±2℃。每份樣本用400mL IS BPW進行淋洗，從每份雞肉淋洗液中各取36mL和30mL，分別用於Veriflow SS和FDA推薦方法檢測。
表3 Veriflow SS 和FDA參考方法食品基質（生肉，即食食品，乳製品和雞胴體）檢測POD結果

基質	菌株	MPN/ 檢測		Veriflow SS			參考方法
			nb	xc	PODCd	95% Cle	x	PODRf	95% Cl	PODC
生牛肉	S.Typhimurium ATCC 14028	_	5	0	0.00	0.00,0.43	0	0.00	0.00,0.43	0.00
		0.11	20	15	0.75	0.53,0.89	15	0.75	0.53,0.89	0.00
		0.34	5	5	1.00	0.57,1.00	5	1.00	0.57,1.00	0.00
熱狗	S. Infantis ATCC 51741	_	5	0	0.00	0.00,0.43	0	0.00	0.00,0.43	0.00
		0.58	20	9	0.45	0.26,0.66	9	0.45	0.26,0.66	0.00
		4.38	5	5	1.00	0.57,1.00	5	1.00	0.57,1.00	0.00
牛奶	S. Choleraesuis ATCC 10708	_	5	0	0.00	0.00,0.43	0	0.00	0.00,0.43	0.00
		0.45	20	6	0.30	0.15,0.52	7	0.35	0.18,0.57	-0.05
		2.46	5	5	1.00	0.57,1.00	4	0.80	0.57,1.00	0.20
整雞淋洗液	Naturally occurring	Lot 1	20	4	0.20	0.08,0.42	5	0.25	0.11,0.47	-0.05
		Lot 2	20	7	0.35	0.18,0.57	10	0.50	0.30,0.70	-0.15

 
a.MPN=最大可能數，使用AOAC MPN計算方法統計參考方法檢測樣品的POD（陽性率）值；b.n=試驗數量；c.x=陽性樣本的數量；d.POD_C：陽性結果除以總試驗次數得到的陽性率；e.Cl=置信區間；如果dPOD的CI不包含零，則該差異在5％的水平上具有統計學意義；f._=未接種樣品
2 結果與分析
2.1 性能穩定性和批次穩定性研究
    性能穩定性實驗結果證明：操作步驟的變動不會影響Veriflow SS的測試性能。實驗結果符合AOAC-RI PTM要求的分數計算，且所有的陽性樣本都經FDA和USDA參考方法確認。這些結果表明，某些測試參數的變化不會直接影響Veriflow SS的測定性能。
    批次間穩定性實驗清晰地表明：3個批次的Veriflow SS不同使用時間點的測定性能都保持一致。同時，這些結果也說明Veriflow SS在12個月的使用期限間，均能保持穩定的測定性能。
2.2 包容性和排他性研究
    該實驗結果表明：Veriflow SS能準確的檢測104株不同的沙門氏菌屬。與包容性結果一致，排他性研究結果也證明Veriflow SS能準確區分沙門氏菌屬和其他細菌。
2.3 食品基質檢測方法結果比較
    食品基質檢測結果：3個不同接種水平的樣品，低濃度的檢測樣中，Veriflow SS檢測方法和FDA 參考方法陽性檢出率無顯著差異，所有的隻接種幹擾菌的樣本，通過兩種方法的檢測結果均為陰性，故兩種方法統計學上不存在顯著性差異。
    整雞胴體檢測結果：基於POD統計分析，兩種方法不存在顯著性差異（陽性樣品均采用參考方法確認）。
3 討論和結論
    上述檢測結果說明：與FDA和USDA參考方法相比，對於乳、肉、整雞和即食食品等8種基質中104種沙門氏菌的檢測，Veriflow SS與FDA和USDA參考方法的檢測結果無顯著差異，具有很好的特異性、準確性和可靠性。在整個試驗過程中，沒有出現假陽性和假陰性結果。與參考方法相比，Veriflow不需要複雜樣品製備，僅需18~24h就可以得到準確的檢測結果，大大短於參考方法3~4天的檢測時間。因此，本研究的結果表明：Veriflow沙門氏菌檢測係統是一種靈敏、可靠和簡單易操作的快速致病菌檢測方法。
參考文獻：
[1] U.S. Food and Drug Administration (2001) Bacteriological Analytical Manual, Ch. 5, “Salmonella,” https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm.