異源蛋白在絲狀真菌中高效表達策略研究進展

　　在絲狀真菌中實現高效表達的同源或異源蛋白很多，但是酶的高效表達與多個因素相關：宿主自身的特征，插入的外源基因或表達宿主自身的特征以及兩者之間的不相容性或者相互影響而產生的一係列變化，使目的蛋白基因在表達宿主中很難實現高效表達。為了實現在絲狀真菌中異源蛋白的高效表達，可以從兩個方麵來控製，一方麵提高目的蛋白的表達量;另一方麵抑製其它蛋白的分泌。其策略也可以從兩方麵來控製：一是外界條件，主要包括pH、溫度、培養基等;二是基因的構建，主要包括使用高效強啟動子、使用融合蛋白、使用轉錄因子、使用CCAAT圖案的功能元件、構建蛋白酶缺陷株、增強基因拷貝數、構建高效的表達盒子、使用CRISPR/Cas9技術來編輯基因等。

　　外界條件的優化

　　不同的蛋白生長條件是不一樣的，適應目的蛋白的條件不一定適應其它蛋白，那麼可以通過改變外界的條件，間接地抑製其它蛋白的產生，從而促進目的蛋白的生長。不同的生長環境和不同的培養方法，都會影響異源蛋白的表達。菌體的生長反過來也會改變培養基的流動性，造成碳源、氮源、氧氣和pH值等在發酵罐中分布不均。那麼通過對接種量、碳源、氮源、發酵溫度、轉速、發酵時間以及pH的優化，可以提高目的蛋白的活力。

　　基因的構建

　　使用強啟動子。經研究發現，為使絲狀真菌能高效分泌異源蛋白，往往選用一些宿主自身的強啟動子來進行調控。王兵兵成功構建了具有潮黴素B抗性標記的重組質粒pHB9，其中將來自黑曲黴的纖維二糖酶基因插入強啟動子Pcbh1(包括分泌信號肽序列)和來自裏氏木黴的Tcbh1終止子，從而提高蛋白的表達量。構建蛋白酶缺陷株。研究發現絲狀真菌自身表達的蛋白酶能夠明顯影響異源蛋白的產量，那麼可以根據這一特點，采取誘變或基因敲除等技術篩選出特異的蛋白酶缺陷的絲狀真菌突變株，有的實驗采用SMD1168蛋白酶缺陷性菌株，其Pep4基因突變，無蛋白水解酶活性，對表達的外源性蛋白產物降解極小，可明顯提高蛋白表達量。增強基因拷貝數。引入多拷貝的表達載體，一般可以提高表達量。楊紹輝等人采用修飾信號肽，增加基因拷貝數的方法，實現高效表達。一般地說，目的基因整合到基因組中拷貝數越多，其轉化子zeocin的抗性越強。因此，利用高濃度的zeocin平板可篩選到高拷貝數轉化子，實現高效表達。使用轉錄因子。轉錄因子能控製基因的轉錄，可以調控RNA聚合酶與DNA模板的結合。通過表達轉錄因子hacA的活化形式可以實現黑曲黴中未折疊蛋白反應通路的組成型誘導，改善mRNA水平，從而提高外源蛋白的生產。使用CCAAT圖案的功能元件。CCAAT圖案被認為是真核生物中大量基因的高水平表達所必需的功能元件。它特異性結合蛋白激活物，然後引發一係列導致高水平基因表達的相互作用。通過將多個拷貝的含有CCAAT的蛋白質結合序列引入啟動子來改善黑曲黴中的異源基因表達。構建高效的表達盒子。隨著研究的不斷進行，出現了以上傳統的提高外源基因表達策略的兩種相結合使用，出現了表達盒，有研究表明，使用組合型的強啟動子以及增加異源基因的整合拷貝數的方法進行表達，但是其表達效果不是很好，其原因可能是在進行外源基因整合時，其整合的拷貝數是不確定的。所以說表達盒由於外源基因整合的隨機性，使表達量的結果不太樂觀。

　　CRISPR/Cas9技術。該技術是利用靶點特異性的RNA將Cas9核酸酶帶到基因組上的具體靶點，從而對特定基因位點進行切割導致突變。使用該係統，內源基因組中的DNA序列及其功能輸出可以在幾乎任何選擇的生物體中容易地編輯或調節。CRISPR/Cas9技術可以定向的敲除基因，敲除率幾乎達到了100%，但是有的敲除率比較低，經研究表明載體構建時選擇的啟動子以及選擇的策略不同，都會影響基因的敲除率，為了提高基因編輯效率最好選用同源強啟動子。脫靶效應一直是該技術需要克服的重大技術問題。

　　隨後，在一項新的研究中，韓春雨發現來自格氏嗜鹽堿杆菌(Natronobacterium gregoryi)的一種Argonaute蛋白(NgAgo)作為一種核酸內切酶，在向導DNA(guide DNA,gDNA)的引導下，能夠在人細胞中進行基因組編輯，通過設計進行大量的實驗，發現NgAgo-gDNA具有廣泛的基因組靶向範圍和較低的錯配耐受性，NgAgo能準確地將DNA片段插入到基因組中，與Cas9-sgRNA相比，NgAgo-gDNA具有更大的優勢，規避了脫靶效應，其應用前景是不言而喻的。

　　問題分析

　　經研究發現，目前大多數還是使用傳統的改造基因構造的策略，比如使用強啟動子，增強基因的拷貝數，構建融合蛋白等，來提高異源蛋白的表達量，但是CRISPR/Cas9技術可以彌補傳統方法上的不足，能更加準確地切割特定的位點，但是在查閱相關文獻時，國內的大部分研究依舊是傳統的高效表達策略，看不到與CRISPR/Cas9有關的內容。另一方麵，雖然CRISPR/Cas9成為目前基因編輯最重要也最先進的技術，但是脫靶效應一直是它存在的主要問題，最近有人發現它可能會導致基因組不穩定性和破壞其他正常基因的功能，這將是CRISPR/Cas9係統應用於生物醫學和臨床應用的一個主要問題。

　　近年來，隨著CRISPR/Cas9係統的改進和完善以及新的基因編輯工具的出現，使基因編輯更加簡單，但是脫靶效應仍然存在，通過設計實驗最大可能地提高目標活性，減少脫靶效應，從而實現更有效的遺傳篩選和基因工程。有實驗表明Cas9脫靶活性取決於sgRNA序列和實驗條件，如John G.Doench就構建sgRNA活性的預測模型來發現改進活性的序列特征。這為減少脫靶效應提供了方向，此外，NgAgo-gDNA基因編輯係統的出現，可以預見未來的基因編輯發展的新方向，這將為基因定點突變、基因功能的挖掘、治療醫療疾病模型的構建以及創製新的資源帶來突破性的進展。

　　王春麗 朱鳳妹 河北科技師範學院食品科技學院