HPLC法測定玉米中的玉米赤黴烯酮含量

    摘　要：玉米赤黴烯酮又稱F-2毒素、ZEA，主要會汙染玉米、小麥、大麥、小米、大米和燕麥等穀物。本文主要通過對國標檢測方法的優化，對濃縮重溶等方式建立分析方法，保證了上機檢測濃度，提高了檢測效率，使回收率和精密度均滿足國標GB/T 27404-2008的要求。
    關鍵詞：玉米赤黴烯酮　玉米　高效液相色譜法
    玉米赤黴烯酮又稱F-2毒素、ZEA，主要會汙染玉米、小麥、大麥、小米、大米和燕麥等穀物。ZEA具有和雌激素類似的結構，可與雌激素受體結合，發揮雌激素效應，其作用強度為雌激素的十分之一。ZEA可引起卵巢病變，幹擾動物排卵、延長發情間期、減少胎仔數或引起不孕等^[1]。
    我國規定穀物及其製品中的玉米赤黴烯酮限量指標為小於等於60μg/kg^[2]，一般采用液相色譜、氣相色譜和試劑盒等方法進行檢測。
    本文通過對國家標準GB 5009.209-2016^[3]/第一法進行優化，分別對方法檢出限濃度、定量限濃度、限量指標濃度等進行加標實驗，結果表明，用HPLC法進行ZEA質量濃度的測定，回收率和精密度均滿足GB/T 27404-2008^[4]的要求。
1 試劑和材料
    超純水、乙腈（色譜級）、甲醇（色譜級）、ZEA標準物質（PriboLab）、提取液（乙腈：水=84:16，v/v）^[5]、PBS緩衝液（Hyclone）、吐溫-20、ZEA免疫親和柱（Romer）。
2 儀器
    安捷倫1100高效液相色譜儀、熒光檢測器、離心機、氮吹儀。
3 標準溶液
    3.1  標準儲備液：準確稱取適量的標準品(精確至0.0001g)，用乙腈溶解，配製成濃度為100μg/mL的標準儲備液，-18℃以下避光保存。
    3.2 標準工作液：用流動相稀釋，配製成10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL的係列標準工作液，4℃避光保存。
4 實驗方法
    4.1 提取
    本次實驗采用市售玉米碴，經過高速粉碎機粉碎後，準確稱取5g（0.001g）放於50mL離心管中，加入20mL提取液，渦旋振蕩2min後，置於離心機中，8000rpm離心10min。上清液通過玻璃纖維濾紙過濾，棄去初濾液3mL，收集餘下濾液。準確吸取3mL濾液於50mL離心管中，加入25mL PBS緩衝液，混勻。
    4.2 淨化
    將免疫親和柱恢複至室溫後與固相萃取裝置連接，再將上樣器連接於小柱上端，加入樣品與PBS混合液，使混合液緩慢通過小柱，棄去流出液。待混合液完全流出小柱時，先向上樣器中加入10mL0.1%吐溫-20進行淋洗，再加入10mL水繼續淋洗，棄去全部流出液。最後將小柱下方連接5mL收集管，用0.5mL甲醇洗脫3次，收集洗脫液。
    4.3 濃縮
    將收集到的1.5mL左右的洗脫液於低於45℃氮氣緩緩吹幹，再用流動相重新溶解並定容至1mL，過0.22μmPTFE濾膜，待上機。
    4.4 空白試驗
    不稱取樣品，按4.1~4.3的步驟做空白試驗。
    4.5 色譜條件
    色譜柱：迪馬科技C18色譜柱，4.6mm×150mm，5μm；流動相：乙腈+水+甲醇=46+46+8，體積比；流速：1mL/min；檢測波長：激發波長274nm，發射波長440nm；進樣量：40μL；柱溫：35℃。
5 結果與討論
    5.1 標準曲線

    圖5.1和5.2可以看出，在ZEA的濃度為10ng/mL~ 500ng/mL範圍內，y=0.037x-0.059，r=0.99998。因此，可以用外標法進行ZEA質量濃度的測定。ZEA的質量濃度=（峰麵積+0.059）/0.037。     5.2 回收率與精密度
    本次實驗中，空白試驗與樣品中均未檢出ZEA。加標試驗結果見表5.1。
    5.3 討論
    本次實驗較之國標方法，減少了取樣量以及上機檢測的進樣量，通過濃縮重溶等方式保證了上機檢測濃度，提高了檢測效率。加標試驗結果可達到國標GB 5009.209-2016[3]/第一法的檢出限，並滿足GB/T 27404-2008對方法確認的要求，證明本方法在實驗室中檢測玉米中的ZEA含量是可行的。
參考文獻：
    [1] 高爽，梁珍，鄧俊良，楊顏銥，陳芸.玉米赤黴烯酮和脫氧血腐鐮刀烯醇對雌性動物的生殖毒性及作用機製，動物營養學報，2016,28（4）：1042-1049.
    [2] 世界杯赛程预测 國家標準 食品中真菌毒素限量，GB 2761-2011.
    [3] 世界杯赛程预测 國家標準 食品中玉米赤黴烯酮的測定，GB 5009.209-2016.
    [4] 實驗室質量控製規範 食品理化檢測，GB/T 27404-2008附表F.1和F.2.
    [5] 朱孟麗，彭聰，洪振濤.高效液相色譜法對飼料中玉米赤黴烯酮的測定，飼料工業，2007年第28卷第1期，37-38.