酸奶中乳酸菌計數方法的探討

　　摘 要：目的是通過方法的選擇對乳酸菌計數方法進行優化。方法：采用塗布法和傾注法分別對6種市售的酸奶製品進行檢測，並分別用生理鹽水、PBS緩衝液、CYS緩衝液進行乳酸菌計數結果比較。結果：6種酸奶製品分別用傾注法和塗布法所得的乳酸菌數結果從統計學意義上均無差別;6份樣品在三種不同稀釋液的計數結果裏CYS緩衝液為最優稀釋液。結論：傾注法和塗布法對乳酸菌計數無影響，若僅對樣品中乳酸菌做計數要求，則可選擇采用傾注法進行檢測，選擇CYS緩衝液進行乳酸菌計數明顯優於國標方法，可以用於食品中乳酸菌計數。

　　關鍵詞：大豆蛋白酶解產物 生物活性肽 輕度酶解苦味肽 功能特性

　　近年來，由於人們生活水平和健康意識的提高，酸奶已成為一種深受廣大消費者喜愛的乳製品之一，但其在生產製作或運輸過程中如儲存不當，會使當中乳酸菌的數量減少，而酸奶營養價值主要來源於其中乳酸菌的數量多少，故酸奶中活性乳酸菌的數量減少直接影響酸奶的質量[1]。確計數活性乳酸菌製品中的乳酸菌，衛生部於2010年發布了修訂版《食品微生物檢驗乳酸菌檢驗》GB 4789.35-2010[2]，與2008版相比修訂版中修改了乳酸菌總數、乳杆、雙岐杆菌、嗜熱鏈球菌的計數方法。但該標準中僅規定了一種平板塗布法作為檢測樣品中乳酸菌數量的方法，且要求操作者從樣品稀釋到平板塗布在15分鍾內必須完成。筆者以多年從事乳酸菌數量檢測工作經驗認為，對於少量樣品的檢測，按照國標來操作是完全可以實現的，但在實際工作中，往往由於種種原因的限製，對於大樣本大樣本量(n>20)，仍采用國際來進行檢測，具有非常大的實際困難。因此，本文從市麵上隨機選取6種品牌的酸奶，通過比較平板塗布法與傾注培養法之間的差異，以及不同稀釋液結果比較，以保證真實反映酸奶中乳酸菌數量可供進一步修改國標的參考依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 隨機選擇6份不同商品名的含活性乳酸菌含量較高、均勻性較好的酸奶製品。

　　1.1.2 稀釋液：(1)生理鹽水、(2)PBS緩衝液、(3)CYS緩衝液(L-半胱氨酸磷酸鹽緩衝液:L-半胱氨酸鹽酸鹽0.20g，磷酸氫二鈉2.40g，磷酸二氫鉀1.80g，吐溫800.24g，於400mL純化水中，攪拌使其充分溶解;以NaOH溶液調pH為6.8~7.0，滅菌條件121℃、15min)。

　　1.2方法

　　1.2.1 平板法：將上述樣品根據待檢樣品活菌數估計，選擇2~3個連續的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取0.1mL樣品勻液分別置於2個MRS瓊脂平板，使用L形玻璃棒進行表麵均勻塗布，每個稀釋度更換一個L形玻璃棒。同時做空白對照。

　　1.2.2 傾注法：將上述樣品根據待檢樣品活菌數估計，選擇2~3個連續的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1mL樣品勻液分別置於2個空培養皿中，傾入50℃左右的MRS瓊脂約20mL，輕輕振搖混勻，待凝固後翻轉平皿。

　　1.2.3 統計分析：采用 SPSS11.5統計軟件，用數據表示，采用“兩獨立樣本t檢驗”以P<0.05表示統計學差異。

　　2 結果：

　　2.1塗布法和傾注法對乳酸菌計數結果的影響

　　樣品稀釋過程按照GB 4789.35-2010食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗操作，分別進行平板塗布和常規傾注進行培養。分別采用塗布法和傾注法，以稀釋時間為立即，對六份樣品中乳酸菌總數檢測結果見表1。

　　6份樣品分別用傾注法和塗布法所得的乳酸菌數結果從統計學意義上均無差別。

　　2.2 三種稀釋液中乳酸菌計數結果比較

　　6份樣品經不同稀釋液稀釋後分別采用塗布法對乳酸菌測定的結果見表2。

　　3. 討論：

　　本實驗采用成組設計的兩樣本均數檢驗(Independent Sample t Test)分析方法，對6種市售酸奶製品分別采用塗布法和傾注法來計數酸奶中乳酸菌菌落數，結果表明，該兩種方法測得的結果之間的差異無統計學意義。根據研究結果顯示，塗布法和傾注法對乳酸菌計數無影響是一致的。塗布法培養後乳酸菌生長在瓊脂表麵，便於挑取菌種做驗證試驗和保存菌種等，但缺點是其樣品稀釋液用L形棒塗布必須均勻否則乳酸菌生長不均對結果造成影響[4]傾注法為常規檢測方法即樣品加樣後再傾注培養基混勻進行培養，技術操作簡便，樣品混勻後能均勻生長，然而培養後菌落大多生長在瓊脂內部，如需鑒定試驗時會帶來一定的困難。另外，通過優化方法不同稀釋液中結果比較，6份樣品在CYS緩衝液中結果較高。由於生理鹽水沒有緩衝能力，會導致某些樣品不能夠溶解和分散充分，影響最終的計數結果。PBS和CYS中磷酸鹽可提供緩衝能力，而CYS中L半胱氨酸能夠為乳酸菌的生長提供還原性的環境，吐溫80能夠使菌體分散更充分，為乳酸菌生長提供有利環境。

　　綜上所述，若在一批檢測樣本數量較多的情況下，僅要求對乳酸菌進行計數的條件下，筆者建議可采用傾注法培養。因為實驗表明傾注法與國標推薦的塗布法對乳酸菌計數結果無統計學差異，且傾注法在操作技術上優於塗布法，可大大縮短操作時間，提高實驗結果的準確性。另外將CYS作為稀釋液更適用於益生菌食品中乳酸菌檢驗，建議在國標修訂時可考慮更換稀釋液。

　　參考文獻：

　　[1]周淩華,王豪,王蔭榆,等. 功能性益生乳酸菌的研究進展[J].天然產物研究與開發，2012(7): 990-995.

　　[2]GB 4789.35-2010世界杯賽程預測國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗[S].北京：中國標準出版社，2010.

　　[3]朱寶玉,張秀麗,廖興,等. 活性乳酸菌製品中乳酸菌計數條件的優化研究 [J].中國衛生檢驗雜誌,2004,14(5):561-563.

　　[4]俞漪,曲勤鳳,胡雪蓮.食品中乳酸菌含量傾注法與塗布法結果差異性研究[J].農產品加工·學刊2012.8(8)：137-139

　　[5]王彬,馬永娟,張少紅.培養方式對乳酸菌檢出率的影響[J].職業與健康2008.2(3)：225-226